恩諾沙星化學發(fā)光酶免疫分析方法研究.pdf

1、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)是一種氟喹諾酮類藥物,廣泛應用于獸醫(yī)的疾病治療。但近年來恩諾沙星應用時所產(chǎn)生的不良反應和耐藥性報道越來越多,其在動物性食品中的殘留直接威脅到人類身體健康。目前常用的獸藥殘留檢測方法有高效液相色譜法(HPLC),氣相色譜法(GC),薄層色譜法(TLC)等,這些方法存在樣品前處理繁瑣,儀器昂貴等問題因而不易推廣。因此研究出一種簡便快速且靈敏的測定ENR殘留的方法,對于動物性食品獸藥殘留的檢測具有實

2、際意義。本實驗建立了兩種不同發(fā)光體系的ENR化學發(fā)光酶免疫分析方法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),并進行了實際樣品的檢測。
　　 1.堿性磷酸酶-金剛烷(ALP-AMPPD)體系CLEIA測定ENR方法的建立。包被緩沖液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(CB,pH9.6),包被抗體濃度為2μg/mL,包被方法為熱包被,37℃,150分鐘,采用碳化二亞胺的偶聯(lián)方法,透析時

3、間為6天,用0.01 mol/L pH7.2的PBS緩沖液稀釋偶聯(lián)物,最佳化學發(fā)光反應時間為8分鐘,發(fā)光劑用CB緩沖液1:4(V發(fā)光劑:VCB)稀釋后每孔加入25μL。在最佳檢測條件下進行的競爭CLEIA檢測,得到的ENR線性回歸方程為:Y=-0.9961x+6.6992,其中Y為發(fā)光值的對數(shù),x為相應ENR濃度的對數(shù),相關(guān)系數(shù)為0.9977,線性范圍為350～1000 pg/mL,檢測限為239.9 pg/mL,批內(nèi)RSD為7.33％

4、～9.08％(n=5),批間RSD為9.52％～13.28％(n=5),標準回收率為96.3％～103.3％。
　　 2.辣根過氧化物酶-魯米諾-過氧化氫(HRP-Luminol-H2O2)體系CLEIA測定ENR方法的建立。包被緩沖液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(CB,pH9.6),包被抗體濃度為3μg/mL,包被方法為熱包被,37℃,150分鐘,采用碳化二亞胺的偶聯(lián)方法,透析時間為5天,用0.01 mol/L pH7.

5、2的PBS緩沖液稀釋偶聯(lián)物,封閉溫度為25℃,封閉時間為2小時,封閉量為150μL/孔,最佳免疫反應時間為1小時,免疫反應溫度為37℃,最佳化學發(fā)光反應時間為3分鐘,發(fā)光劑用CB緩沖液1:2(V發(fā)光劑:VCB)稀釋后每孔加入25μL。在最佳檢測條件下進行的競爭CLEIA檢測,得到的ENR線性回歸方程為:Y=-0.3059x+6.3904,其中Y為發(fā)光值的對數(shù),x為相應ENR濃度的對數(shù),相關(guān)系數(shù)為0.9974,線性范圍在350～1000p

6、g/mL之間,檢測限為30.2 pg/mL,批內(nèi)RSD為7.75％～9.42％(n=5),批間RSD為9.19％～13.05％(n=5),標準回收率為99.9％～100.0％。
　　 3.實際樣品檢測中CLEIA法與HPLC法、ELISA法分析結(jié)果的比較,三種方法的檢測限依次為30.2pg/mL,6.0ng/mL,3.6ng/mL,測定牛奶樣品時,三種方法分別測定5次,其平均回收率依次為96.7％,88.6％,94.3％,相對標

7、準偏差依次為8.27％,3.72％,10.28％；測定雞蛋樣品時,三種方法分別測定5次,其平均回收率依次為97.0％,90.8％,94.4％,相對標準偏差依次為7.98％,3.13％,9.40％；測定蜂蜜樣品時,三種方法分別測定5次,其平均回收率依次為97.9％,89.2％,93.7％,相對標準偏差依次為8.46％,3.61％,10.07％；測定血漿樣品時,三種方法分別測定5次,其平均回收率依次為98.2％,86.6％,92.5％,相對