基于酶聯(lián)免疫法的中華絨螯蟹體內(nèi)恩諾沙星藥代動力學(xué)研究.pdf

1、恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是第3代喹諾酮類抗生素,因其具有高效、抗菌譜廣、與其它抗生素之間無交叉耐藥性等特性而被應(yīng)用于防治水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病。中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是名貴養(yǎng)殖品種之一,在養(yǎng)殖過程中常遭受細(xì)菌性疾病危害,ENR也是防治中華絨螯蟹細(xì)菌性疾病的常用藥,因而存在殘留的風(fēng)險。色譜法檢測ENR殘留檢測限低、高效,但樣品前處理較為繁瑣、耗時、成本高。因而,本研究通過優(yōu)化ENR多克隆抗體制備

2、技術(shù),建立了靈敏、特異、快速、簡便的ELISA分析方法,并應(yīng)用該檢測方法研究了給藥次數(shù)、健康狀況、水溫等因素對中華絨螯蟹體內(nèi)ENR藥代動力學(xué)及殘留消除規(guī)律的影響,取得如下主要結(jié)果：
　?、挪捎脙?yōu)化的碳二亞胺法合成免疫原(cBSA-ENR)、N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法合成包被抗原(cOVA-ENR)及免疫方式等技術(shù),制備ENR多克隆抗體,并用方陣ELISA及間接競爭ELISA對其滴度、親和力及特異性進(jìn)行分析。結(jié)果表明, ENR多抗的

3、工作濃度為1:80000,IC50為8.68 ng/mL,有效檢測范圍為0.40~125 ng/mL,與環(huán)丙沙星等競爭物的交叉反應(yīng)率均小于0.50％;分別在中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺樣品中添加10、30和90 ng/g(ng/mL)3個濃度水平的ENR,平均回收率分別為72.23％~85.45％、68.66％~74.12％和50.17％~56.30％,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.64％~12.26％、12.41％~22.23％和28.28

4、％~35.40％。說明采用優(yōu)化的制備技術(shù)獲得的ENR多克隆抗體及其建立的免疫分析方法能夠滿足中華絨螯蟹等水產(chǎn)品中ENR殘留檢測的基本要求。
　?、圃趩未魏投啻慰诠?連續(xù)口灌三天,每天一次)的給藥方式下,中華絨螯蟹血淋巴和肌肉中ENR含量均呈現(xiàn)隨給藥時間先上升后下降的現(xiàn)象。單次口灌中華絨螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺的吸收半衰期(T1/2ka)分別為0.27 h、0.27 h、2.18 h,分布半衰期(T1/2α)分別為3.65 h、7.

5、39 h、19.86 h,消除半衰期(T1/2β)分別為15.26 h、29.94 h、42.92 h;而多次口灌下3種組織中的T1/2ka分別為0.26 h、0.24 h、0.07 h,T1/2α分別為3.81 h、9.04 h、23.05 h,T1/2β分別為18.50 h、33.21 h、48.41 h。表明單次口灌比多次口灌分布和消除都快;各組織中ENR含量從大到小依次為:肝胰腺、血淋巴、肌肉。3P97軟件分析結(jié)果表明,不同給藥

6、次數(shù)下中華絨螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中ENR的代謝規(guī)律均符合一級吸收二室開放模型;。根據(jù)農(nóng)業(yè)部無公害食品獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn),建議25℃水溫條件下口服ENR(10 mg/Kg)預(yù)防中華絨螯蟹疾病時休藥期不少于375℃?d。
　?、窃谒疁?5℃時,以10 mg/kg劑量單次口灌健康的和感染嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹后,ENR在健康組中華絨螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺的T1/2ka分別為0.27 h、0.27 h、2.18 h,T1/2α分別為3.

7、65 h、7.39 h、19.86 h,T1/2β分別為15.26 h、29.94 h、42.92 h;而染菌組3種組織中的T1/2ka分別為0.87 h、1.35 h、2.56 h,T1/2α分別為1.34 h、2.59 h、8.61 h,T1/2β分別為14.04 h、40.28 h、7.96 h。與健康蟹相比,染菌蟹各組織中ENR含量較低、吸收較慢,但分布和消除快。ENR在各組織中的含量從大到小依次為:肝胰腺、肌肉、血淋巴。3P9

8、7軟件分析結(jié)果表明,不同健康狀況下中華絨螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中ENR的代謝規(guī)律均符合一級吸收二室開放模型。建議25℃水溫條件下口服ENR(10 mg/Kg)治療中華絨螯蟹疾病時休藥期不少于300℃?d。
　?、仍?0、25和30℃水溫下,以10 mg/kg劑量單次口灌人工感染了嗜水氣單胞菌的中華絨螯蟹后,血淋巴和肌肉組織中ENR含量均出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象,而肝胰腺中藥物時間曲線均出現(xiàn)兩個峰值,且第二峰峰值濃度均高于第一個峰峰