Exploring Ssr Markers Based on the Bes and Est Sequences for the Linkage Map of Citrus.pdf

1、微衛(wèi)星標(biāo)記現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于植物生物學(xué)以及植物育種學(xué)等研究領(lǐng)域,但是目前在柑橘屬植物中所開(kāi)發(fā)的SSR標(biāo)記數(shù)量還比較有限。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中柑橘BAC文庫(kù)末端序列(BES序列)和EST序列,開(kāi)發(fā)了4856對(duì)新的柑橘SSR分子引物,并且通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)全面評(píng)價(jià)了這些SSR標(biāo)記在柑橘及其近緣屬植物種間的通用性、多態(tài)性,及其在柑橘群體遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力,利用這些標(biāo)記,構(gòu)建了紅橘×枳殼的遺傳連鎖圖譜,具體結(jié)果如下:
　　

2、1.利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的BES序列和EST序列,通過(guò)Primer3軟件分別設(shè)計(jì)了1025和3831對(duì)SSR引物,成功設(shè)計(jì)的這些引物對(duì)分別占到了預(yù)測(cè)的SSR位點(diǎn)的85.06％和93.92％。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)在柑橘基因組中富含AT基序。利用400對(duì)BES-SSR引物和439對(duì)EST-SSR引物在16個(gè)柑橘或其近緣種中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,333對(duì)BES-SSR引物(83.25％)和368對(duì)EST-SSR引物(83.83％)具有擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、r>　　 2.將含有SSR位點(diǎn)的EST序列和BES序列通過(guò)blast搜索,結(jié)果顯示2613條EST序列(占總序列76.22％)和236條BES序列(27.03％)能夠找到與其相匹配的已知蛋白序列。功能注釋顯示60.12％的EST序列以及16.38％的BES序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中功能蛋白同源。由于有些序列功能分類并不止一種分類方式,因此在每一功能分類中BES或者EST序列比例總數(shù)并不等于100％。GO分類結(jié)果顯示,40.78％的EST-SS

4、R序列和13.52％的BES-SSR序列參與分子功能,43.82％的EST-SSR序列和0.57％的BES-SSR序列分別參與細(xì)胞組分,47.17％的EST-SSR序列和11.00％的BES.SSR序列參與生物進(jìn)程。
　　 3.利用16個(gè)不同的柑橘及其近緣屬材料檢測(cè)BES-SSR和EST-SSR引物通用性,結(jié)果顯示,76.99％的BES-SSR和65.00％的EST-SSR測(cè)試引物具有通用性。在BES-SSR和EST-SSR引物

5、中,六核苷酸重復(fù)序列基序的SSR引物通用性都是最高的。在所開(kāi)發(fā)的柑橘EST-SSR引物中,具有多態(tài)性的引物的比例沒(méi)有BES-SSR類高。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn),利用3’末端EST序列開(kāi)發(fā)的SSR引物要好于5’末端所開(kāi)發(fā)的引物。在16個(gè)柑橘及其近緣屬中,利用EST-SSR引物所擴(kuò)增的片段,其序列相似度要高于利用BES-SSR所擴(kuò)增的片段。EST-SSR引物擴(kuò)增序列相似度為92％-100％,而B(niǎo)ES-SSR所擴(kuò)增序列相似度為52％-100％。

6、>　　 4.為了評(píng)價(jià)我們所開(kāi)發(fā)的兩類SSR引物在構(gòu)建群體遺傳連鎖圖譜中的效力,利用16個(gè)不同基因型柑橘植株,推導(dǎo)得到169個(gè)假定組合,我們主要統(tǒng)計(jì)了雜合位點(diǎn)百分比,多態(tài)性雜合位點(diǎn)百分比以及圖譜構(gòu)建能力百分比。BES-SSR類標(biāo)記的雜合位點(diǎn)百分比在每一柑橘基因型中都高于EST-SSR標(biāo)記。在各品種間,紅橘和甜橙兩品種雜合比例最高,枳殼雜合比例最低,酸橙居中。我們所用的材料中,也包含種間雜種,例如葡萄柚,枸櫞,柚,紅橘,橘等,他們的多態(tài)性

7、雜合位點(diǎn)比率都很高,適合于遺傳圖譜比較研究。通過(guò)比較假定組合中多態(tài)性位點(diǎn)比例,我們認(rèn)為未來(lái)可以構(gòu)建檸檬和柚,紅橘和枳殼,檸檬和紅橘,柚和檸檬雜交F1代群體,為今后遺傳圖譜比較奠定基礎(chǔ)。
　　 5.利用BES-SSR類引物和EST-SSR引物分別對(duì)35個(gè)柑橘及其近緣屬材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示,兩類引物都可以在35份材料中檢測(cè)到遺傳變異,并且都具有高度多態(tài)性。BES-SSR引物產(chǎn)生的confusion probability

8、值較EST-SSR.的低,而confusion probability值與discriminating capacity值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),所以與EST-SSR相比,BES-SSR具有較高的鑒別力。每一對(duì)引物的limit of discriminatingpower均值與actual discrimination power值很相近。BES-SSR標(biāo)記產(chǎn)生的effectivenumber of patterns per assay unit(

9、P)值最高,達(dá)到27.48。由兩類引物計(jì)算得到的total number of effective alleles值,Assay efficiency index,Effective multiples ratio,Marker index都很相近。兩類分子標(biāo)記在35份柑橘及其近緣屬材料中產(chǎn)生的種系關(guān)系圖與前人研究結(jié)果相吻合,并且兩類標(biāo)記產(chǎn)生的聚類圖具有高度一致,只有個(gè)別材料在聚類圖中有所不同。
　　 6.在柑橘中,利用SSR分

10、子標(biāo)記評(píng)價(jià)其群體遺傳結(jié)構(gòu)等相關(guān)研究比較少,本研究比較了BES-SSR和EST-SSR標(biāo)記在三個(gè)群體中的群體遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,兩類SSR標(biāo)記產(chǎn)生的群體遺傳參數(shù)在相同群體個(gè)體中極其相似。
　　 7.利用本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的紅橘×枳殼雜交群體(102單株),選用1291對(duì)SSR標(biāo)記引物,其中包含了我們所開(kāi)發(fā)的高效EST-SSR,BES-SSR以及已經(jīng)發(fā)表的SSR標(biāo)記,構(gòu)建高密度柑橘遺傳連鎖圖譜,最終有36.64％的SSR引物具有群體作圖

11、能力。在作圖群體中共得到382分離位點(diǎn),其中有66個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出偏分離,最終選擇313個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建雜交群體框架圖。遺傳連鎖分析結(jié)果表明,在313個(gè)位點(diǎn)中,227個(gè)位點(diǎn)是連鎖位點(diǎn),剩余的86個(gè)為不連鎖位點(diǎn),連鎖位點(diǎn)分布在15個(gè)連鎖群中,紅橘×枳的圖譜總長(zhǎng)24293.9 mM,平均每位點(diǎn)距離107.02mM。同時(shí)我們也將45個(gè)偏分離位點(diǎn)添加到圖譜中,并且大部分位點(diǎn)坐落在第一連鎖群中。
　　 本研究中利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中柑橘EST序列和克里曼