黑木相思遺傳多樣性及寒脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、黑木相思(Acacia Melanoxylon)屬含羞草科(Mimosaceae)金合歡屬(Acacia Mill.)。自然分布于澳大利亞布里斯班以南,至南澳州的東南部和塔斯馬尼亞島,是近年來我國南方引種的主要用材樹種之一,它具有適應(yīng)性強(qiáng)、速生豐產(chǎn)、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)。但由于種源地屬熱帶地區(qū),大多種源對低溫仍較為敏感,引種實(shí)踐證明,在閩北及其以北地區(qū)長勢較差,閩北低溫是其種苗越冬的主要限制因子;另外,其實(shí)生苗在栽培中性狀分化十分嚴(yán)重,制約了

2、高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的黑木相思人工林的發(fā)展。因此,研究黑木相思優(yōu)樹遺傳多樣性、抗寒性,鑒定寒脅迫誘導(dǎo)下差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,可為進(jìn)一步闡明黑木相思的抗寒機(jī)理,培育出性狀穩(wěn)定的抗寒相思優(yōu)良品系提供理論依據(jù);這對黑木相思優(yōu)良種源引種適宜區(qū)的選擇、優(yōu)異抗逆林木的早期選擇和種質(zhì)資源庫建設(shè)具有重要而深遠(yuǎn)的意義。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了黑木相思優(yōu)樹遺傳多樣性,采用抗寒評估技術(shù)對供試黑木相思優(yōu)樹進(jìn)行了抗寒性評估,采用cDNA-AFLP技術(shù)對黑木相

3、思寒脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)基因進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下：
　　 ⑴建立了黑木相思基因組DNA快速提取方法。采用1.5×CTAB法提取黑木相思葉狀柄的基因組DNA,其分子大小約為48Kb,得率約為180-697.5μg·g-1,A260/A280=1.75～1.955,無需經(jīng)Rnase處理,可直接用于限制性酶切和ISSR分析。
　　 ⑵采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化和建立了黑木相思ISSR-PCR體系,篩選了多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的ISSR引物1

4、0條,并對其擴(kuò)增程序和引物退火溫度進(jìn)篩選優(yōu)化：①在20μL反應(yīng)體系中,含引物0.30μmol·L-1、Mg2+3.00mmol·L-1,dNTP0.15mmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.75U和模板DNA2.00ng·μL-1。②進(jìn)行33個(gè)循環(huán):94℃變性35s,52-61.5℃退火52s,72℃延伸90s;循環(huán)結(jié)束后,72℃延伸10min。
　　 ⑶黑木相思優(yōu)樹遺傳多樣性ISSR分析的驗(yàn)證。用ISSR標(biāo)記技術(shù),采用上述

5、優(yōu)化的黑木相思ISSR-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù),從加拿大哥倫比亞大學(xué)[UBC)公布的第9套(共計(jì)100條ISSR引物)中篩選出的10條引物,對37個(gè)黑木相思優(yōu)樹進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示:37個(gè)黑木相思優(yōu)樹之間存在較高的遺傳多樣性;而引自福建不同栽培地域的優(yōu)樹之間的遺傳多樣性則相對較小,這與引種黑木相思種源背景資料相一致,與引種栽培事實(shí)相符。37個(gè)黑木相思優(yōu)樹間的Nei&Li(1979)遺傳距離表明:供試的37個(gè)黑木相思優(yōu)樹之間存在

6、較大的遺傳分化,這種遺傳分化顯現(xiàn)出顯著的地域性;相對而言,3個(gè)來自建甌的抗寒優(yōu)樹相對具有較高的遺傳多樣性;16個(gè)引自廣東的優(yōu)良無性系根孽苗優(yōu)樹具有較高的遺傳多樣性和較小的遺傳分化;7個(gè)引自廣東的優(yōu)良無性系采種實(shí)生苗優(yōu)樹遺傳多樣性最低,且遺傳分化較大;這與引種黑木相思種源背景和種源試驗(yàn)的栽培客觀事實(shí)相符。研究結(jié)果表明:ISSR分子標(biāo)記技術(shù)適用于黑木相思的遺傳多樣性分析。基于ISSR標(biāo)記的黑木相思37個(gè)優(yōu)樹的聚類分析表明:3個(gè)引自建甌的抗寒

7、優(yōu)樹與其它34個(gè)黑木相思優(yōu)樹親緣關(guān)系可能較遠(yuǎn);引自廣東的16個(gè)優(yōu)良無性系根孽苗優(yōu)樹與其半同胞優(yōu)樹(7個(gè)優(yōu)良無性系采種實(shí)生苗優(yōu)樹)優(yōu)樹聚為一支,說明了它們之間的親緣關(guān)系;這與種源背景和栽培事實(shí)相符。研究結(jié)果表明:ISSR分子標(biāo)記技術(shù)適用于黑木相思的親緣關(guān)系鑒定。另外,篩選出的10個(gè)引物對3個(gè)抗寒優(yōu)樹的擴(kuò)增,共擴(kuò)增出748個(gè)特異遺傳位點(diǎn),其中3個(gè)抗寒優(yōu)樹共有的特異遺傳位點(diǎn)有22個(gè),可作為區(qū)別于其他34個(gè)優(yōu)樹的ISSR分子標(biāo)記,另外26個(gè)特異

8、遺傳位點(diǎn)可與22個(gè)共有特異遺傳位點(diǎn)配合使用,作為3個(gè)抗寒優(yōu)樹之間相互區(qū)分的ISSR標(biāo)記。
　　 ⑷黑木相思的抗寒性評估。應(yīng)用電導(dǎo)法配以Logistic方程求拐點(diǎn)溫度作為黑木相思的低漏半致死溫度,能較直觀且準(zhǔn)確地反映黑木相思的抗寒力和所能忍耐的低溫極限,可作為黑木相思抗寒性評估的有效方法。黑木相思的抗寒性大小與其寒脅迫過程中,細(xì)胞中MDA含量累積幅度相關(guān),即抗寒性強(qiáng)的無性系,其細(xì)胞中MDA含量累積幅度小,抗寒性弱的無性系,其細(xì)胞中

9、MDA含量累積幅度大,因此,寒脅迫中,黑木相思細(xì)胞中MDA含量累積幅度大小可作為其抗寒性評估的檢測指標(biāo)。低溫脅迫下黑木相思可溶性糖含量變化與其抗寒性的關(guān)系復(fù)雜,部分種源細(xì)胞可溶性糖累積與其杭寒性呈負(fù)相關(guān);低溫下黑木相思細(xì)胞可溶性糖的累積作用,對提高其抗寒性可能是間接的,更多的可能趨向于誘導(dǎo)啟動(dòng)抗寒的其它過程,間接提高抗寒性。低溫脅迫下黑木相思脯氨酸含量變化與其抗寒性的關(guān)系復(fù)雜,部分種源細(xì)胞脯氨酸累積與其抗寒性呈負(fù)相關(guān);低溫下黑木相思細(xì)胞

10、脯氨酸的累積作用,更多的可能趨向于提高細(xì)胞的滲透濃度有,進(jìn)而誘導(dǎo)啟動(dòng)抗寒的其它過程,或只是低溫脅迫的結(jié)果。
　　 ⑸建立了適于cDNA-AFLP的黑木相思組培苗總RNA快速提取方法。采用改良CTAB-異硫氰酸胍裂解法能有效地控制多酚、多糖、蛋白質(zhì)以及DNA等對所提取總RNA的污染,所得總RNA質(zhì)量高、完整性好;紫外分光光度檢測,A260/A280比值為1.96-2.0,A260/A230比值1.98-2.2,總RNA得率為118

11、.4-213.6μg·g-1,電泳檢測,28SrRNA亮度約為18SrRNA的兩倍,所提RNA質(zhì)量可以滿足dscDNA合成和cDNA-AFLP等后續(xù)分子操作要求。
　　 ⑹建立了黑木相思雙低頻酶eDNA-AFLP反應(yīng)體系。以黑木相思組培苗為實(shí)驗(yàn)材料,對影響cDNA-AFLP反應(yīng)體系的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究,建立了適用于黑木相思的cDNA-AFLP分析體系。結(jié)果表明:適用于黑木相思dscDNA的限制性酶切組合為EcoRI和Pst I,

12、dscDNA酶切用量為500 ng。用作預(yù)擴(kuò)增模板的連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)為1倍,用作選擇性擴(kuò)增模板的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)為50倍。
　　 ⑺考察脅迫誘導(dǎo)黑木相思差異表達(dá)基因的分離和鑒定。采用cDNA-AFLP技術(shù),得到黑木相思響應(yīng)低溫脅迫差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄譜,并對圖譜中有差異變化的147個(gè)TDF測序,測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性比對分析,其中下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?個(gè),上調(diào)表達(dá)基因?yàn)?40個(gè),這些基因主要有:鋅指蛋白、GTP酶激活蛋白、鳥嘌呤核苷