選擇性捕獲雞白痢沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列.pdf

1、雞白痢沙門(mén)菌呈世界范圍分布。目前，在西方部分發(fā)達(dá)國(guó)家雞白痢已經(jīng)被消滅或基本消滅，而在國(guó)內(nèi)該病的危害仍嚴(yán)重。雞白痢沙門(mén)菌多造成2-3周齡雛雞死亡，成年雞則可帶菌而無(wú)臨床癥狀。感染后存活的雞常表現(xiàn)生殖系統(tǒng)病變，引起蛋雞產(chǎn)蛋量下降，并污染種蛋，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病既可垂直傳播，又可水平傳播，造成嚴(yán)重的危害。探究雞白痢沙門(mén)菌潛在的致病基因，了解其致病機(jī)理，對(duì)于尋求新的有效防治措施具有重要的意義。
　　 隨著各種分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究

2、手段的出現(xiàn)，人們對(duì)病原體在感染宿主過(guò)程中轉(zhuǎn)錄基因序列的研究也逐漸深入。選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(selective capture oftranscribed sequences，SCOTS)技術(shù)在研究病原體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究比較了雞白痢沙門(mén)菌在雞體內(nèi)和體外巨噬細(xì)胞系中的存活消亡趨勢(shì)，以雞巨噬細(xì)胞系HD-11為侵染模型，用SCOTS技術(shù)捕獲該菌在巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄序列，并初步分析了其中一個(gè)序列在侵染細(xì)胞過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平。

3、r>　　 ⑴雞白痢沙門(mén)菌體內(nèi)外侵染實(shí)驗(yàn)。為了探究雞白痢沙門(mén)菌S06004在與雞體單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)和體外巨噬細(xì)胞系的相互作用的過(guò)程中，細(xì)菌定殖、復(fù)制的變化趨勢(shì)，進(jìn)行了細(xì)菌的體內(nèi)侵染實(shí)驗(yàn)和體外巨噬細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)侵染實(shí)驗(yàn)中，以口服和肌注兩種方式感染9日齡非免疫海藍(lán)蛋雞，感染后第三天吞噬細(xì)胞中的細(xì)菌量都達(dá)到最高點(diǎn)，第九天下降到每克組織中帶菌量不足500 cfu，且這種狀態(tài)能夠持續(xù)至少5天。在體內(nèi)侵染實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌的定殖趨勢(shì)為先發(fā)生復(fù)制增殖、

4、后消減至很低水平，并且低水平的帶菌狀態(tài)會(huì)維持一段時(shí)間。同時(shí)在體外侵染實(shí)驗(yàn)中，不論給予細(xì)菌1h還是2.5h的作用時(shí)間，進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌量在增殖3h左右時(shí)都達(dá)到最高點(diǎn)，消減到較低的水平后，能夠維持一段時(shí)間。在體外實(shí)驗(yàn)中胞內(nèi)的細(xì)菌同樣具有先增殖后消減，并維持一段低水平細(xì)菌攜帶率的平臺(tái)期的存活趨勢(shì)。雞白痢沙門(mén)菌S06004株對(duì)雞巨噬細(xì)胞系HD-11的體外侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體內(nèi)吞噬細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，故采用雞白痢沙門(mén)菌侵染雞巨噬細(xì)胞系HD-

5、11可以在一定程度上模擬細(xì)菌體內(nèi)感染時(shí)與內(nèi)臟器官吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的相互作用。
　　 ⑵選擇性捕獲雞白痢沙門(mén)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列。應(yīng)用SCOTS方法鑒定雞白痢沙門(mén)菌S06004株在感染雞巨噬細(xì)胞系HD-11過(guò)程中細(xì)菌表達(dá)的基因。根據(jù)細(xì)菌體內(nèi)和體外侵染實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，選用雞白痢沙門(mén)菌S06004侵染雞巨噬細(xì)胞系HD-11，以模擬細(xì)菌體內(nèi)侵染吞噬細(xì)胞過(guò)程，通過(guò)SCOTS技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄序列cDNAs的選擇性捕獲，檢測(cè)了細(xì)菌在與巨噬細(xì)胞相互作

6、用過(guò)程中毒力基因以及相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)，共得到16個(gè)序列。除了一個(gè)未知序列，這些體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列包括毒力相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)中分泌素蛋白和Ⅰ型分泌系統(tǒng)中外膜蛋白的編碼基因、代謝相關(guān)的敏感激酶和核苷水解酶的編碼基因、運(yùn)輸功能基因、一些質(zhì)粒編碼基因以及環(huán)境適應(yīng)性功能基因等。
　　 ⑶實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)分析雞白痢沙門(mén)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列7-6在侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)SCOTS技術(shù)捕獲得到的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列7-6，設(shè)計(jì)了針對(duì)其特異性檢測(cè)的一對(duì)引