利用SCOTS技術(shù)篩選腸炎沙門菌在不同源巨噬細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列.pdf

1、腸炎沙門菌是一種對人類和動物都有高致病性的沙門菌血清型，與人類感染關(guān)系密切，是重要的食源性病原菌和人畜共患菌。食入被污染的肉制品（主要是禽類）及蛋制品是人類腸炎沙門菌病爆發(fā)的主要危險因素之一。腸炎沙門菌感染人類主要表現(xiàn)為以小腸結(jié)腸炎為代表的胃腸道疾病。通常，這類感染具有自身限制性并且在3-5天內(nèi)被清除。腸炎沙門菌感染兩周齡以內(nèi)的禽類則表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀和高水平的死亡率，同時腸炎沙門菌能侵襲產(chǎn)蛋母雞造成全身性感染并傳遞給子代。目前，對腸

2、炎沙門菌致病機制的研究雖然有一定的進展，但仍處于初級階段。因此，尋求腸炎沙門菌潛在的致病基因?qū)τ诹私馄渲虏C理及有效地防治腸炎沙門菌病都具有重要的意義。本研究運用SCOTS(selectivecaptured of transcribed sequences)篩選和鑒定了腸炎沙門菌在感染禽源和鼠源巨噬細胞過程中腸炎沙門菌的轉(zhuǎn)錄序列，為全面認識腸炎沙門菌的致病機理提供了基礎(chǔ)。
　　1.選擇性捕獲腸炎沙門菌在不同源巨噬細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列

3、
　　選取鼠源巨噬細胞RAW264.7和禽源巨噬細胞HD-11作為細胞模型，比較并分析了腸炎沙門菌C50041菌株對兩種細胞的侵染能力及胞內(nèi)的增殖變化趨勢。結(jié)果顯示:腸炎沙門菌對禽源巨噬細胞的侵染率高于鼠源巨噬細胞，且腸炎沙門菌在兩種不同源巨噬細胞內(nèi)的增殖趨勢存在明顯的差異。在此基礎(chǔ)上，利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列技術(shù)(SCOTS)篩選細菌感染巨噬細胞2hr時的表達序列，通過cDNA序列同源性比對分析蛋白的功能。結(jié)果顯示:在侵染禽源巨噬

4、細胞和鼠源巨噬細胞過程中分別篩選獲得了58個和54個轉(zhuǎn)錄序列。其中包括毒力基因、代謝相關(guān)基因、環(huán)境適應性相關(guān)基因、分子合成和降解相關(guān)基因、調(diào)控基因、轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因和功能未知基因。研究顯示腸炎沙門菌在感染不同源巨噬細胞過程中，除個別表達序列相同，多數(shù)表達序列存在明顯差異，為揭示腸炎沙門菌對不同宿主的致病機制提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　2.實時熒光定量PCR檢測SCOTS篩選序列在細菌感染過程中的表達情況
　　本研究采用SYB

5、R(R)Green實時定量PCR方法，通過相對定量分析(2-ΔΔCT)來比較腸炎沙門菌感染巨噬細胞2hr和在胞內(nèi)增殖5hr時，腸炎沙門菌在細胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄水平與體外的差異。根據(jù)SCOTS篩選結(jié)果，我們隨機從腸炎沙門菌感染HD-11中篩選所得的58個序列中隨機選取12個基因（invJ、ycaM、 bigA、SEN4299、SEN3610、SEN0988、nlpB、SEN2555、SEN0815、SEN2967、stdB和yiaG），從腸

6、炎沙門菌感染RAW264.7中篩選所得的54個序列中選取12個基因(dnaG、cbiK、rbfA、copS、rseB、rtcR、rfaQ、secG、spvB、flgX、lpfC和phoB)，檢測其在HD-11和RAW264.7中的表達情況。結(jié)果顯示，所有基因在兩種巨噬細胞中都得到了表達，證明了SCOTS技術(shù)的可靠性。同時，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除個別基因在胞內(nèi)表達水平與體外培養(yǎng)過程中不存在差異，多數(shù)基因在感染細胞過程中表達明顯上調(diào)。其中，細菌侵

7、染HD-11過程中篩選的基因在感染HD-112 hr時的表達量均低于增殖5hr的量，而在RAW264.7中，各基因仍表達，且表達量與在HD-11中無顯著差異。而細菌侵染RAW264.7過程中篩選的基因在感染RAW264.72 hr時的表達量與增殖5hr時無顯著差異，但在HD-11中，各基因的表達量顯著下調(diào)，尤其是在增殖5hr點，其表達量下降水平明顯。此外，部分基因在細菌感染細胞的過程中上調(diào)表達水平達到20倍以上，有的甚至達到100倍，對