腸炎沙門菌轉錄因子SEN2967和SEN3610調控基因的篩選與鑒定.pdf

1、腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis，S.Enteritidis，SE)是革蘭陰性兼性胞內寄生菌，對人類和動物都具有致病性，是重要的人獸共患病原菌。轉錄因子（Transcription factor，TF）是一類能夠結合在特定基因上游特異核苷酸序列上的蛋白，并能調控該基因的轉錄。轉錄因子可調控細菌毒力因子的表達，參與生理生化代謝過程，因此對沙門菌轉錄因子的研究對于沙門菌致病機制與防控

2、研究都具有重要意義。本實驗室前期研究中利用SCOTS技術篩選腸炎沙門菌感染禽源巨噬細胞HD-11的過程中表達的基因，兩個候選轉錄因子SEN2967和SEN3610基因的胞內轉錄水平顯著高于體外培養(yǎng)狀態(tài)下的表達水平，但國內外對這兩個假定轉錄調控因子的研究未見報道。
　　本研究通過同源重組的方法成功構建了腸炎沙門菌SEN2967和SEN3610基因缺失株及其誘導型表達株;并通過雙向電泳、iTraQ技術對二者調控的基因表達進行了分析;對

3、于篩選獲得的基因，采用EMSA進行驗證。
　　1.腸炎沙門菌C50041轉錄因子SEN2967和SEN3610的缺失株與表達株的構建及其生物學特性鑒定
　　利用熒光定量PCR比較腸炎沙門菌C50041感染HD-11細胞5h后與體外培養(yǎng)條件下轉錄水平的表達差異，證實SEN2967上調約98倍，SEN3610上調約15倍。本研究利用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構建了腸炎沙門菌缺失株C50041ΔSEN2967、C50041ΔSEN

4、3610*pBad24及以pBad24為載體的誘導型表達株C50041ΔSEN2967(pBad24-SEN29673*Flag)、C50041ΔSEN3610(pBad24-SEN36103*Flag)。Western Blot結果顯示，誘導型表達株中SEN2967和SEN3610蛋白經(jīng)誘導后均成功表達。生物學特性結果表明，SEN2967和SEN3610的缺失均不影響腸炎沙門菌的生理生化特性;小鼠體內競爭實驗表明，SEN2967和SE

5、N3610缺失株的致病力均明顯低于野生株C50041。腸炎沙門菌SEN2967和SEN3610基因缺失株和誘導型表達株的成功構建為后期篩選SEN2967和SEN3610調控的基因表達研究提供了相應的生物材料。
　　2.腸炎沙門菌C50041轉錄因子SEN2967和SEN3610的蛋白質組學研究
　　本研究通過雙向電泳分析SEN2967和SEN3610缺失株與表達株的蛋白表達水平差異。分別提取SEN2967和SEN3610的缺

6、失株和表達株的全菌蛋白，在確保上樣量一致的前提下，進行雙向凝膠電泳，銀染后掃描獲得2D圖譜，經(jīng)PD Quest軟件分析，檢測出SEN2967的缺失株和表達株有56個差異蛋白點，檢測出SEN3610的缺失株和表達株有91個差異蛋白點。隨后我們利用iTraQ技術檢測缺失株與表達株中表達差異的蛋白譜，在差異倍數(shù)≥1.5或者≤0.67倍，P值≤0.05的條件下，SEN2967缺失株與誘導型表達株相比，上調表達的蛋白有81個，下調表達的蛋白有90

7、個，共計差異數(shù)量171; SEN3610缺失株與表達株相比，上調表達的蛋白有25個，下調表達的蛋白有21個，共計差異數(shù)量46。這一結果與雙向電泳均表明SEN2967和SEN3610基因的缺失或誘導表達可以引起細菌中其它蛋白表達的變化。iTraQ結果進一步顯示，在SEN2967和SEN3610缺失株中下調表達的蛋白庫中存在與T3SS緊密相關的蛋白，主要包括SPI-1和SPI-5的效應蛋白，以及與針狀結構形成相關的蛋白。選擇部分與T3SS相

8、關且表達量差異明顯的蛋白表達基因，利用熒光定量PCR檢測轉錄水平的表達差異，結果表明轉錄水平與翻譯水平的表達并非平行關系。本研究篩選獲得的蛋白為進一步研究SEN2967和SEN3610在腸炎沙門菌轉錄調控過程中參與的信號通路奠定了基礎。
　　3.腸炎沙門菌C50041轉錄因子SEN3610調控基因的EMSA驗證
　　為了篩選和鑒定轉錄因子SEN3610直接調控的基因，我們利用EMSA實驗來檢測轉錄因子和調控的基因啟動子之間的

9、相互作用。首先利用pMAL-5載體成功構建了SEN3610原核表達載體，獲得重組菌株、E.coli ER2523(pMAL-c5X-SEN3610)和E.coli ER2523(pMAL-p5X-SEN3610);純化回收MBP-SEN3610融合蛋白約40 mg，并經(jīng)透析后用于EMSA實驗。根據(jù)第二章篩選獲得的基因序列，分別定位其啟動子序列，通過兩級PCR合成5'FAM熒光標記的探針。在EMSA反應體系下驗證SEN3610與各探針的結