黃瓜類(lèi)金屬硫蛋白2(CsMT-L2)的原核表達(dá)與金屬螯合能力研究.pdf

1、金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類(lèi)低分子量、高Cys含量、具有金屬結(jié)合能力的多肽，最早在蓄積鎘的馬腎組織中發(fā)現(xiàn)，而在植物中分離的與動(dòng)物MT同源的蛋白被稱(chēng)為植物類(lèi)金屬硫蛋白(Metallothionein Like，MT-L)。根據(jù)Cys的位置與排列方式，植物類(lèi)金屬硫蛋白被分為三類(lèi)。Ⅰ類(lèi)與Ⅱ類(lèi)MT的最大區(qū)別在于前者的Cys集中分布在肽鏈的N端和C端，中間由一段不含Cys的間隔區(qū)相連，后者的Cys則散布在整個(gè)肽鏈中；而

2、第Ⅲ類(lèi)MT為非基因編碼產(chǎn)物，是以谷胱甘肽為底物酶促合成的多聚物。目前對(duì)植物類(lèi)金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究還不夠深入，普遍認(rèn)為其與金屬結(jié)合有關(guān)。
　　 黃瓜類(lèi)金屬硫蛋白2(CsMT-L2)基因由本實(shí)驗(yàn)室在黃瓜果實(shí)cDNA文庫(kù)分析中得到鑒別和克隆，其功能尚未得到研究。本研究將該基因在原核中表達(dá)，分析其表達(dá)的蛋白對(duì)金屬離子的螯合能力，并與人的金屬硫蛋白的β結(jié)構(gòu)域和類(lèi)植物螯合肽相比較；同時(shí)，將CsMT-L2的兩個(gè)富含Cys的區(qū)域直接相連

3、，構(gòu)成中間連接區(qū)缺失突變體CsMT-L2m，探討該蛋白中間連接區(qū)的功能。該研究將為深入揭示金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供理論依據(jù)，闡明Ⅰ類(lèi)植物類(lèi)金屬硫蛋白的中間連接區(qū)的作用，為該基因的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　 1.成功構(gòu)建4個(gè)相關(guān)原核表達(dá)載體。
　　 利用高保真PrimStar HS DNA聚合酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到4個(gè)相關(guān)基因，分別連接到pET32a+原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)區(qū)域，經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序驗(yàn)證，4個(gè)

4、基因成功插入載體中并且可讀框正確。
　　 2.CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMT-L2和PcL等4個(gè)融合蛋白在原核表達(dá)中得到了大量表達(dá)。
　　 四個(gè)融合蛋白經(jīng)過(guò)原核表達(dá)、MagneHisTM蛋白純化系統(tǒng)純化、SDS-PAGE電泳檢測(cè)、S-TagWestern Blot，均得到了預(yù)期大小的目的條帶。
　　 3.證實(shí)了4種融合蛋白在大腸桿菌體內(nèi)具有金屬螯合能力。
　　 通過(guò)火焰原子光譜法測(cè)定結(jié)合Zn2

5、+、Cd2+金屬含量，CsMT-L2、CsMT-L2m、PcL、HsMTb融合蛋白在菌體內(nèi)吸附Zn2+能力分別為1.37×10-5mol/g、0.693×10-5mol/g、0.948×10-5 mol/g、0.911×10-5mol/g，而CsMT-L2、CsMT-L2m、HsMTb、PcL融合蛋白在菌體內(nèi)吸附Cd2+能力分別為1.25×10-4 mol/g、3.43×10-5mol/g、1.15×10-5 mol/g、7.67×10

6、-5 mol/g，均明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，說(shuō)明四種蛋白都具有金屬結(jié)合的能力，但是四個(gè)相關(guān)蛋白金屬結(jié)合能力是有明顯的差異，其中CsMT-L2結(jié)合Zn2+、Cd2+能力最強(qiáng)，PcL次之，可能與結(jié)構(gòu)有關(guān)。其中，改造的金屬硫蛋白(CsMT-L2m)金屬結(jié)合能力明顯下降(尤其Cd2+的影響較大)，說(shuō)明中間連接區(qū)對(duì)于兩個(gè)富含Cys區(qū)域之間的協(xié)調(diào)以及整個(gè)構(gòu)象正確折疊發(fā)揮重要的作用。
　　 4.明確了蛋白CsMT-L2與CsMT-L2

7、m的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)和高級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　 運(yùn)用生物信息學(xué)的方法和軟件對(duì)其信號(hào)肽、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化關(guān)系等重要參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)和推斷。結(jié)果表明：CsMT-L2與CsMT-L2m為無(wú)信號(hào)肽蛋白，非分泌、非跨膜蛋白，CsMT-L2包含三個(gè)磷酸化位點(diǎn)，CsMT-L2沒(méi)有磷酸化位點(diǎn)，CsMT-L2的二級(jí)結(jié)構(gòu)由Alpha helix(Hh)、Extended strand(Ee)、Random coil(Cc)三