奶牛隱性乳腺炎免疫傳感器診斷技術(shù)的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是嚴(yán)重危害奶牛健康的主要疾病之一,包括臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎兩種類型。臨床型乳腺炎具有明顯的臨床癥狀,診斷較為容易;隱性乳腺炎則缺乏臨床癥狀,必須借助實(shí)驗(yàn)室手段才能進(jìn)行診斷。長期以來,臨床上建立隱性乳腺炎的診斷方法主要依賴于直接或間接計(jì)數(shù)牛奶體細(xì)胞(somatic cell)或?qū)θ橹M(jìn)行微生物培養(yǎng)。近年來,通過檢測牛奶中的急性時(shí)相蛋白(acute phase protein, APP)以建立奶牛隱性乳腺炎的診斷逐漸受到重視。

2、結(jié)合珠蛋白(haptoglobin, Hp)是牛的一種主要APP,該物質(zhì)主要由肝臟合成,在正常牛奶中含量極低以致無法檢出。在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中,由于血-乳屏障的通透性升高,Hp可通過血-乳屏障進(jìn)入到牛奶中。因此,牛奶中Hp含量升高被認(rèn)為是奶牛發(fā)生乳腺炎的標(biāo)志之一。盡管目前已有用于檢測Hp的商品化ELISA檢測試劑盒,但其檢測過程耗時(shí)較長、自動(dòng)化程度低,不適應(yīng)現(xiàn)場檢測的要求。免疫傳感器檢測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型檢測技術(shù),其基本檢

3、測原理與ELISA方法相似,但可將抗原-抗體反應(yīng)信號通過電化學(xué)傳感裝置進(jìn)行放大和輸出,從而實(shí)現(xiàn)快速、靈敏和自動(dòng)化檢測。
　　本研究的目的在于構(gòu)建檢測牛奶中Hp含量的免疫傳感器,以期為診斷奶牛隱性乳腺炎提供新的技術(shù)和方法。本研究內(nèi)容分為三部分。第一部分,在普魯士藍(lán)/鄰苯二胺/納米金修飾電極上組裝牛結(jié)合珠蛋白抗體的電流型免疫傳感器的研制。以電化學(xué)三電極系統(tǒng)為基本裝置,以金電極為工作電極,鉑絲電極為對電極,Ag/AgCl電極為參比電極,

4、通過電沉積方法將普魯士藍(lán)(PB)沉積于金電極表面,在其上電聚合鄰苯二胺(o-PDA)以防止PB滲漏,并依次將納米金顆粒和抗牛Hp抗體(濃度為5.0 mg/L)組裝到金電極表面,制得免疫傳感器。該傳感器工作電極在Hp抗原溶液中的最適孵育時(shí)間為15min,掃描底液最適pH值為6-7。在最適檢測條件下,該傳感器對Hp的檢測靈敏度在5-10mg/L之間。第二部分,在L-半胱氨酸/納米金修飾電極上固定結(jié)合珠蛋白抗體的免疫傳感器的研究。以三電極系統(tǒng)

5、中的金電極為工作電極,采用層層自組裝技術(shù)將L-半胱氨酸、納米金顆粒和抗牛Hp(濃度為5.0 mg/L)抗體依次組裝在工作電極上,制成免疫傳感器。制成的免疫傳感器對Hp的線性檢測范圍為15-100mg/L,最低檢測限為0.63mg/L。分別采用該傳感器和ELISA檢測試劑盒對隱性乳腺炎患牛乳樣中Hp含量進(jìn)行檢測,結(jié)果表明該兩種方法的檢測結(jié)果之間無顯著差異(P＞0.05)。第三部分,免疫傳感器診斷法與常用隱性乳腺炎診斷法的比較。在杭州市近郊

6、某奶牛場選取20頭臨床健康奶牛作為實(shí)驗(yàn)對象。隨機(jī)選取每頭奶牛的前后兩個(gè)乳區(qū)采集奶樣,采用乳汁病原菌培養(yǎng)法、HMT法、SCC法以及本研究構(gòu)建的L-半胱氨酸/納米金/Hp抗體免疫傳感器診斷隱性乳腺炎。分別以細(xì)菌學(xué)檢測陽性、HMT檢測陽性(評分等級為1-3)、SCC≥50×104個(gè)/ml和Hp≥3.9mg/L為隱性乳腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對各種方法的診斷結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,并采用Kappa檢驗(yàn)進(jìn)行診斷符合率分析?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明,傳

7、感器診斷方法得出的隱性乳腺炎陽性和陰性診斷結(jié)果與SCC法診斷結(jié)果之間差異顯著(P＜0.05),但與乳汁病原菌培養(yǎng)法和HMT法診斷結(jié)果之間差異不顯著(P＞0.05)。Kappa檢驗(yàn)結(jié)果亦表明,傳感器檢測方法與SCC法診斷結(jié)果符合率較低(Kappa＜0.40),但與細(xì)菌學(xué)檢測方法和HMT檢測方法得到的診斷結(jié)果相符合(Kappa＞0.40).上述結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的L-半胱氨酸/納米金/Hp免疫傳感器可用于診斷奶牛隱性乳腺炎。
　　綜