一氧化氮合酶及其相關(guān)因子在凡納濱對(duì)蝦免疫反應(yīng)中特性的研究.pdf

1、本文檢測(cè)了病原模式分子β-1,3葡聚糖（Laminarin）、脂多糖（LPS）、及RNA病毒模式分子（poly I:C）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）和對(duì)蝦白斑病毒（WSSV）刺激后凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）體內(nèi)重要的免疫相關(guān)因子在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化和部分重要免疫指標(biāo)的變化；克隆得到了重要免疫因子一氧化氮合酶（NOS）以及與其活性調(diào)控和信號(hào)傳遞密切相關(guān)因子精氨酸激酶（AK）和兩

2、種亞型鈣調(diào)蛋白（LvCaM-long、LvCaM-short）的全長(zhǎng)cDNA，分析了它們的結(jié)構(gòu)特性，研究了這些基因的組織表達(dá)譜及在對(duì)蝦免疫反應(yīng)中的表達(dá)變化，利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)NOS中NO合成結(jié)構(gòu)域肽段、LvCaM-long、AK進(jìn)行了體外表達(dá)，并研究了與AK相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果如下：
　　得到了病原模式分子、副溶血弧菌和WSSV刺激后凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞和肝胰腺中的病原識(shí)別、酚氧化酶原激活、抗氧化酶、抗菌殺菌等系統(tǒng)因子的表達(dá)變化特征

3、，在一定程度上闡釋了它們?cè)趯?duì)蝦免疫過(guò)程中的角色和機(jī)理。
　　利用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆得到了長(zhǎng)度為4680 bp的凡納濱對(duì)蝦NOS cDNA序列，其ORF為3540 bp，編碼1179個(gè)氨基酸。序列分析表明凡納濱對(duì)蝦NOS主要包含4個(gè)主要的保守結(jié)構(gòu)域，即NO synthase結(jié)構(gòu)域；flavodoxin1結(jié)構(gòu)域；FAD結(jié)合域；NAD結(jié)合域。Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上，肝胰腺中NOS表達(dá)豐度最高

4、，其次是神經(jīng)。副溶血弧菌和WSSV刺激后，血細(xì)胞和肝胰腺中NOS在mRNA水平上的表達(dá)量和酶活力都顯著降低，提示 NOS可能在對(duì)蝦抵抗病原入侵的免疫防御中發(fā)揮了重要作用。對(duì)該基因的NO生成區(qū)進(jìn)行了原核表達(dá)，并純化出了目的蛋白，為進(jìn)一步在蛋白水平上研究NOS提供了條件。
　　凡納濱對(duì)蝦AK基因全長(zhǎng)1446bp，編碼區(qū)1071bp，編碼356個(gè)氨基酸，有兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，分別為ATP-gua PtansN結(jié)構(gòu)域和ATP-gua Ptr

5、ans結(jié)構(gòu)域。對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)，并得到了有活性的表達(dá)產(chǎn)物。Real-time PCR和Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，AK在對(duì)蝦肌肉、血細(xì)胞、胃、心臟和神經(jīng)中均有轉(zhuǎn)錄和翻譯。副溶血弧菌和WSSV刺激后，對(duì)蝦血細(xì)胞、肝胰腺和肌肉中AK基因表達(dá)及酶活力都發(fā)生了明顯變化，同時(shí)肌肉中ATP含量顯著降低，說(shuō)明AK及其調(diào)控的能量代謝在對(duì)蝦的免疫過(guò)程起著重要作用。通過(guò)GST-pull dwon及酵母雙雜交方法，發(fā)現(xiàn)AK與actin T2之間存在

6、蛋白質(zhì)相互作用。
　　克隆得到了1101 bp和689 bp的凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)兩種類型的CaM全長(zhǎng)cDNA，LvCaM-long和LvCaM-short。LvCaM-long編碼區(qū)450bp，編碼149個(gè)氨基酸；LvCaM-short基因編碼區(qū)510bp，可編碼169個(gè)氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)兩種類型的CaM主要包含4個(gè)EF-hand鈣離子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。Real-time PCR發(fā)現(xiàn)LvCaM-long在神經(jīng)中表達(dá)豐度最高，其次是鰓，然