一氧化氮合酶及其相關因子在凡納濱對蝦免疫反應中特性的研究.pdf

1、本文檢測了病原模式分子β-1,3葡聚糖（Laminarin）、脂多糖（LPS）、及RNA病毒模式分子（poly I:C）、副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）和對蝦白斑病毒（WSSV）刺激后凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）體內(nèi)重要的免疫相關因子在轉(zhuǎn)錄水平的表達變化和部分重要免疫指標的變化；克隆得到了重要免疫因子一氧化氮合酶（NOS）以及與其活性調(diào)控和信號傳遞密切相關因子精氨酸激酶（AK）和兩

2、種亞型鈣調(diào)蛋白（LvCaM-long、LvCaM-short）的全長cDNA，分析了它們的結(jié)構特性，研究了這些基因的組織表達譜及在對蝦免疫反應中的表達變化，利用原核表達系統(tǒng)對NOS中NO合成結(jié)構域肽段、LvCaM-long、AK進行了體外表達，并研究了與AK相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果如下：
　　得到了病原模式分子、副溶血弧菌和WSSV刺激后凡納濱對蝦血細胞和肝胰腺中的病原識別、酚氧化酶原激活、抗氧化酶、抗菌殺菌等系統(tǒng)因子的表達變化特征

3、，在一定程度上闡釋了它們在對蝦免疫過程中的角色和機理。
　　利用RT-PCR和RACE-PCR技術克隆得到了長度為4680 bp的凡納濱對蝦NOS cDNA序列，其ORF為3540 bp，編碼1179個氨基酸。序列分析表明凡納濱對蝦NOS主要包含4個主要的保守結(jié)構域，即NO synthase結(jié)構域；flavodoxin1結(jié)構域；FAD結(jié)合域；NAD結(jié)合域。Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平上，肝胰腺中NOS表達豐度最高

4、，其次是神經(jīng)。副溶血弧菌和WSSV刺激后，血細胞和肝胰腺中NOS在mRNA水平上的表達量和酶活力都顯著降低，提示 NOS可能在對蝦抵抗病原入侵的免疫防御中發(fā)揮了重要作用。對該基因的NO生成區(qū)進行了原核表達，并純化出了目的蛋白，為進一步在蛋白水平上研究NOS提供了條件。
　　凡納濱對蝦AK基因全長1446bp，編碼區(qū)1071bp，編碼356個氨基酸，有兩個主要的結(jié)構域，分別為ATP-gua PtansN結(jié)構域和ATP-gua Ptr

5、ans結(jié)構域。對該基因進行原核表達，并得到了有活性的表達產(chǎn)物。Real-time PCR和Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，AK在對蝦肌肉、血細胞、胃、心臟和神經(jīng)中均有轉(zhuǎn)錄和翻譯。副溶血弧菌和WSSV刺激后，對蝦血細胞、肝胰腺和肌肉中AK基因表達及酶活力都發(fā)生了明顯變化，同時肌肉中ATP含量顯著降低，說明AK及其調(diào)控的能量代謝在對蝦的免疫過程起著重要作用。通過GST-pull dwon及酵母雙雜交方法，發(fā)現(xiàn)AK與actin T2之間存在

6、蛋白質(zhì)相互作用。
　　克隆得到了1101 bp和689 bp的凡納濱對蝦體內(nèi)兩種類型的CaM全長cDNA，LvCaM-long和LvCaM-short。LvCaM-long編碼區(qū)450bp，編碼149個氨基酸；LvCaM-short基因編碼區(qū)510bp，可編碼169個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)兩種類型的CaM主要包含4個EF-hand鈣離子結(jié)合的結(jié)構域。Real-time PCR發(fā)現(xiàn)LvCaM-long在神經(jīng)中表達豐度最高，其次是鰓，然