煙草赤星病菌角質(zhì)酶的純化、性質(zhì)及在致病中的作用研究.pdf

1、煙草赤星病是我國煙草的主要病害之一。上世紀(jì)九十年代，曾是煙草生產(chǎn)上的主要葉部病害。為了深入闡明煙草赤星病的發(fā)病機(jī)理，揭示角質(zhì)酶在植物病原互作中的作用，從而為病害的防治提供新的理論依據(jù)及防治手段，本文針對病原菌致病因子，對煙草赤星病菌Alternaria longipes產(chǎn)生的胞外角質(zhì)酶進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化、純化，并對其在致病中的作用進(jìn)行了研究。具體結(jié)果如下： 1.蘋果角質(zhì)作為誘導(dǎo)物，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的煙草赤星病菌TBAZ8，通過正

2、交試驗(yàn)對本菌產(chǎn)生角質(zhì)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果確定了最佳培養(yǎng)時間為8 d，最佳培養(yǎng)溫度為25℃，最佳pH值為5.5，最佳碳源為蔗糖3％，最佳氮源為干酪素1％，Tween-80為0.3％，產(chǎn)酶能力較優(yōu)化前提高了約11倍。 2.煙草赤星病菌TBA28經(jīng)發(fā)酵的培養(yǎng)液經(jīng)80％飽和度的硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析、Sephacryl S-100 HR分子篩層析和Phenyl-Sephar

3、ose Fast Flow疏水層析分離純化到一種角質(zhì)酶，經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后呈單帶，分子量約為59.5 kDa。整個過程回收率為3.52％，純化倍數(shù)為26.44。 3.用p-nitrophenyl butyrate為底物測定了反應(yīng)溫度和pH等對角質(zhì)酶活性的影響。結(jié)果表明，該角質(zhì)酶的反應(yīng)最適溫度為35℃，最適pH值為9.0，溫度在20～40℃及pH 4.0～10.0范圍內(nèi)，酶活較為穩(wěn)定。一些金屬離子如Na+、C

4、u2+和Mn2+可以部分地抑制角質(zhì)酶活性。Ca2+的濃度為2.5和5mmol/L時可部分抑制角質(zhì)酶的活性。而Mg2+和Zn2+的濃度為2.5和5mmol/L時對酶活沒有影響，濃度為10 mmol/L時兩者對酶活都有較強(qiáng)的激活作用。 4.利用離體葉片接種方法，篩選出煙草赤星病菌強(qiáng)毒株TBA003，中強(qiáng)毒株TBA002和弱毒株TBA001。將三個分離物進(jìn)行液體發(fā)酵，結(jié)果表明，煙草赤星病菌的致病力和產(chǎn)角質(zhì)酶的活力大小相一致，證明產(chǎn)角質(zhì)