抗生素耐藥基因在動(dòng)物腸道中的排布和在微環(huán)境中的消減規(guī)律.pdf

1、動(dòng)物生產(chǎn)活動(dòng)極大地促進(jìn)了環(huán)境中抗生素耐藥基因（antibioticresistance genes，ARGs）的發(fā)生和蓄積。畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)使用的抗菌藥物不僅在動(dòng)物腸道內(nèi)選擇了大量的ARGs，還會(huì)通過(guò)糞便進(jìn)入環(huán)境中，對(duì)土著微生物產(chǎn)生選擇壓力。更為重要的是，糞便中含有的高水平背景值的ARGs會(huì)伴隨著糞便，污染養(yǎng)殖場(chǎng)周邊的土壤和下游河流，還會(huì)通過(guò)糞肥傳播到農(nóng)田和蔬菜基地，對(duì)公共健康構(gòu)成潛在的危害。本文立足于此背景，研究了肉雞腸道中ARGs的多樣性

2、和排布規(guī)律，還研究了糞便污染的土壤和水體中ARGs的消減規(guī)律和菌群的變化，最后實(shí)地調(diào)查廣州市流溪河中ARGs的污染情況。本文研究的主要內(nèi)容及結(jié)果分述如下：
　　1.動(dòng)物腸道中耐藥基因的排布規(guī)律
　　研究肉雞的腸道中ARGs的多樣性和排布規(guī)律，并且研究以金霉素作為選擇壓力時(shí)肉雞腸道中ARGs的變化情況。54只肉雞隨機(jī)平均分成三組，包括空白對(duì)照組、低劑量組和治療劑量組，每組三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)六只雞。肉雞在給予金霉素處理前后不同時(shí)

3、間點(diǎn)采集雞糞。提取雞糞的宏基因組，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析耐藥基因的豐度和多樣性，并且定位耐藥基因的宿主菌，明確整合子、質(zhì)粒和噬菌體上的耐藥基因的排列情況。結(jié)果顯示，未接觸抗菌藥物的肉雞，其腸道中含有高濃度的ARGs（平均3.1ARGs/16S rRNA基因）；在正常的給藥方案下，暴露于金霉素的選擇壓力下，肉雞腸道中的耐藥基因特別是四環(huán)素類耐藥基因并沒(méi)有大幅度的顯著性升高。在肉雞養(yǎng)殖過(guò)程中合理的抗菌藥物治療可能不會(huì)顯著增加其腸道的耐藥基因

4、。肉雞腸道中的耐藥基因以多藥耐藥基因?yàn)橹鳎?3.1％），其次是四環(huán)素類耐藥基因（9.3%）。值得注意的是消毒劑吖啶黃耐藥基因污染較嚴(yán)重（7.6%）。攜帶耐藥基因的豐度最高的菌屬是Escherichia（83.2%），其次是Klebsiella（6.0%）和Shigella（5.0%）。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了I類整合子，攜帶有鏈絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Sat1）、氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶（AadA1和AadA2）、氯霉素類（CmlA）、季銨鹽（Qac）和磺胺類

5、（Sul3）的耐藥基因。還發(fā)現(xiàn)噬菌體攜帶有膦胺霉素耐藥基因（Fsm）和消毒劑吖啶黃耐藥基因（AcrA和AcrB）。本實(shí)驗(yàn)首次解析了肉雞腸道中ARGs的排列和分布規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有利于指導(dǎo)臨床合理用藥，并且對(duì)肉雞腸道的耐藥傳播機(jī)制如噬菌體擴(kuò)散耐藥性提供了有力的證據(jù)。
　　2.施糞活動(dòng)對(duì)土壤中耐藥基因和菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　研究了含有常用抗菌藥物的豬糞污染農(nóng)田土壤后，土壤中四環(huán)素類、磺胺類和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾類耐藥（plasmid-me

6、diated quinolone resistance(PMQR)基因的發(fā)生和蓄積規(guī)律，同時(shí)還分析了菌群結(jié)構(gòu)的變化情況。我們將添加糞便和抗菌藥物的土壤作為處理組，包括四環(huán)素類藥物處理組、磺胺類藥物處理組和氟喹諾酮類藥物處理組。只添加糞便的土壤作為糞便組，未添加糞便和抗菌藥物的土壤作為空白對(duì)照組。在第0、30和60天時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組中ARGs的豐度；并且在第30天時(shí)運(yùn)用基于16s rRNA基因的宏基因組測(cè)序的方法分析各組中

7、的菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示施糞后土壤中大部分ARGs（四環(huán)素類耐藥基因：tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ、tetX；磺胺類耐藥基因：sul1、sul2、sul3；PMQR基因：oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr、qnrS）均顯著增加（P<0.05）。四環(huán)素類耐藥基因（tetM、tetO、tetW、tetQ和tetX）、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-

8、Ib-cr和qnrS）在糞便組的每月消減率分別是-38%至-97%、-78%至-83%和-76%至-94%，而這些ARGs在抗菌藥物處理組的消減速率分別是48%至-93%、-50%至-66%和-58%至-84%。含抗菌藥物的糞便顯著選擇了特定菌群，如磺胺類藥物處理后，Steroidobacter、Bradyrhizobium、Nitrospira、Gp4、Gp6、Clostridium和 Stenotrophomonas均顯著增高。結(jié)果

9、表明，施糞活動(dòng)促進(jìn)了耐藥基因在土壤中的發(fā)生和蓄積。糞便中含有的抗菌藥物可延緩施糞土壤中由糞便帶入的耐藥基因的消減速度。同時(shí)含不同類抗菌藥物的糞便對(duì)土壤中的特定的菌群具有選擇作用。
　　3.糞便污染對(duì)河流水中耐藥基因和菌群結(jié)構(gòu)的影響
　　研究了含有常用抗菌藥物的豬糞污染河流水后，底泥和水樣中四環(huán)素類耐藥基因、磺胺類耐藥基因和PMQR基因的發(fā)生和蓄積規(guī)律，同時(shí)分析了抗菌藥物選擇壓力對(duì)底泥和水樣中菌群結(jié)構(gòu)的影響。我們將添加糞便和抗

10、菌藥物的水體作為處理組，包括四環(huán)素類藥物處理組、磺胺類藥物處理組和氟喹諾酮類藥物處理組。只添加糞便的水體作為糞便組，未添加糞便和抗菌藥物的水體作為空白對(duì)照組。底泥樣品中，藥物處理組的四環(huán)素類耐藥基因（tetM、tetO、tetW、tetQ、tetX和tetS）、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）的豐度分別是空白對(duì)照組的1.8～4.5倍、4.5～7.2倍和1.

11、8～4.2倍。與空白對(duì)照組相比，處理組中的抗菌藥物顯著選擇了很多特定的菌群，如四環(huán)素類藥物顯著選擇底泥中的Salmonella、Escherichia/Shigella、Clostridium和 Stenotrophomonas。結(jié)果意味著含有抗菌藥物的糞便對(duì)底泥和水樣中絕大部分的ARGs具有顯著的選擇性，同時(shí)含抗菌藥物的糞便顯著選擇了水體中的包括一些機(jī)會(huì)致病菌在內(nèi)的特定菌群。
　　4.流溪河中耐藥基因和菌群結(jié)構(gòu)分析
　　實(shí)

12、地調(diào)查了廣州市糞源污染嚴(yán)重的流溪河中ARGs的豐度和菌群結(jié)構(gòu)。我們采集了流溪河上游和下游的底泥和河水。大部分檢測(cè)到的耐藥基因（tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ、tetX、sul1、sul2、sul3、oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）的相對(duì)豐度在10-5至10-2之間，絕對(duì)拷貝數(shù)在102至108拷貝數(shù)/克或毫升。一些與機(jī)會(huì)致病菌相關(guān)聯(lián)的菌屬也有發(fā)現(xiàn)，如底泥和水樣的所有樣品中均檢測(cè)到Acinetobact

13、er、Clostridium和Arcobacter，其豐度分別高達(dá)29%、0.68%和0.58%。結(jié)果表明流溪河中ARGs污染較嚴(yán)重。在流溪河中發(fā)現(xiàn)的這些ARGs和與機(jī)會(huì)致病菌相關(guān)聯(lián)的菌屬給河流兩岸的居民健康構(gòu)成潛在的威脅。
　　5.全文結(jié)論
　　動(dòng)物腸道是ARGs的存儲(chǔ)庫(kù)。未接觸抗菌藥物的肉雞，其腸道中仍含有高豐度的ARGs。在正常的給藥方案下，肉雞暴露于金霉素的選擇壓力下，其腸道中的ARGs沒(méi)有大幅度的顯著性變化。肉雞腸

14、道中的ARGs以多藥耐藥基因?yàn)橹?，攜帶耐藥基因的豐度最高的菌屬是Escherichia。肉雞腸道中發(fā)現(xiàn)的攜帶有ARGs的轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和噬菌體可利于ARGs的橫向傳播。
　　動(dòng)物糞便是ARGs向自然環(huán)境（農(nóng)田和河流）傳播的重要媒介。施糞土壤中四環(huán)素類耐藥基因（tetM、tetO、tetW、tetS、tetQ和tetX）、磺胺類耐藥基因（sul1、sul2和sul3）和PMQR基因（oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib和qnrS）