稻瘟病菌SNARE蛋白的生物信息學分析及Mgsec22的功能研究.pdf

1、稻瘟病是影響全球水稻產(chǎn)量的重要病害，其病原真菌（Magnaporthe grisea）與水稻的互作系統(tǒng)已成為研究植物病原真菌與寄主互作較為理想的模式系統(tǒng)之一，稻瘟病菌也是研究絲狀真菌生長發(fā)育和侵染致病機制的重要模式生物。從全基因組水平分析研究稻瘟病菌重要基因的功能，可以加快對稻瘟病菌生物學特征及致病分子機制的認識，為培育長效抗病品種和制定稻瘟病持久控制策略提供了重要的理論依據(jù)。
　　 膜泡運輸過程在所有的真核生物中是相當保守的，

2、運輸小泡與靶膜的融合過程中一類被稱為SNARE（可溶性N一乙基順丁烯二酞亞胺敏感性融合蛋白（NSF）連接蛋白受體蛋白）的整合蛋白是融合事件的關(guān)鍵因子。4個分別來自于不同亞家族Qa-，Qb-，Qc-及R-的SNARE蛋白形成四聚復合體介導膜泡融合過程。本文利用生物信息學手段，根據(jù)已經(jīng)報道的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）及米曲霉（Aspergillusoryzae）中的SNARE蛋白對稻瘟菌中可能存在的SNAR

3、E蛋白進行分析與預測，搜索到21個可能的SNARE蛋白。進一步分析了這些蛋白的二級結(jié)構(gòu)及進化關(guān)系，將其分別歸類至SNARE蛋白的四大亞家族中，同時對這四類蛋白分別進行蛋白序列比對分析，發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌中定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、內(nèi)膜的SNARE蛋白是非常保守的。但是與酵母菌不同的是稻瘟病菌質(zhì)膜上不存在結(jié)構(gòu)相似、功能冗余的Qa-SNARE蛋白，這與A.oryzae一致。提示這些區(qū)別可能與酵母菌和絲狀真菌極性生長、菌落形態(tài)及分泌功能上的差異有關(guān)

4、。
　　 利用生物信息學方法在稻瘟病菌中預測并克隆出一個R-SNARE蛋白的編碼基因命名為Mgsec22，Southern雜交結(jié)果顯示該基因在稻瘟病菌基因組中為單拷貝。酵母突變體功能互補實驗證明，盡管MgSEC22蛋白序列與酵母菌Sec22p在進化距離上相距較遠，但在功能上具有相似性。進一步通過定向的基因敲除方法對其進行了初步的功能探索。結(jié)果顯示，稻瘟病菌Mgsec22突變體與野生型相比氣生菌絲稀薄，生長速率緩慢，幾乎不產(chǎn)生分生

5、孢子，致病力喪失；但該基因突變后對各種細胞壁脅迫因子的耐受性增強：CFW染色觀察發(fā)現(xiàn)突變體細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，幾丁質(zhì)含量明顯提高。已證明活性氧與細胞分化、致病性等密切相關(guān)，本文中NBT染色觀察到該基因的突變體菌絲中活性氧含量顯著降低，進一步Real-time RT-PCR分析表明與活性氧產(chǎn)生相關(guān)的兩個NADPH氧化酶基因Nox1和Nox2表達水平顯著降低。過氧化物酶和漆酶在病原菌致病過程中起到重要作用，分光光度法測定發(fā)現(xiàn)突變體過氧化物酶