丙烯酰胺對(duì)雌性小鼠的生殖毒性和神經(jīng)型一氧化氮合酶在卵巢細(xì)胞中的表達(dá)定位.pdf

1、丙烯酰胺（Acrylamide, ACR）是一種常見(jiàn)的化工原料，廣泛用于飲水凈化、污水處理、造紙、采礦業(yè)及科研實(shí)驗(yàn)等。人類(lèi)在20世紀(jì)80年代之后已經(jīng)對(duì)丙烯酰胺的毒性有了充分的認(rèn)識(shí)。自從2002年瑞士國(guó)家食品監(jiān)督局首次報(bào)道在高溫加熱食品中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺，再一次引起了各國(guó)科學(xué)家的關(guān)注。丙烯酰胺主要通過(guò)食源性的非職業(yè)途徑和職業(yè)性接觸對(duì)人產(chǎn)生毒性作用。此外人體還可能通過(guò)吸煙的途徑接觸丙烯酰胺。
　　 丙烯酰胺是一種已知的神經(jīng)毒性物質(zhì)和人類(lèi)

2、的可能致癌物，目前發(fā)現(xiàn)除職業(yè)接觸外，人們還可通過(guò)日常飲食（如油炸薯片、薯?xiàng)l、高溫烘烤的面包等）攝入大量丙烯酰胺，雖然丙烯酰胺可用被微生物降解，而且由于其具有較高水溶性及低脂溶性，所以不易發(fā)生生物聚集，也不易引起生物放大效應(yīng)。但長(zhǎng)期接觸丙烯酰胺仍可對(duì)生物體產(chǎn)生不良作用：包括影響神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生，影響生殖和發(fā)育等，其危害日益引起人們的重視。
　　 丙烯酰胺的神經(jīng)毒性已經(jīng)為許多學(xué)者所公認(rèn)，大量的中毒事件也多是圍繞其神經(jīng)毒性方面

3、，但是對(duì)雌性動(dòng)物生殖影響的研究比較匱乏。本實(shí)驗(yàn)選用35日齡昆明小鼠飲用丙烯酰胺水溶液，其中一組服用量每天為20mg/kg體重（以下簡(jiǎn)稱(chēng)20mg組），另一組每天為40mg/kg體重（以下簡(jiǎn)稱(chēng)40mg組），對(duì)照組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)control）飲用自來(lái)水。65日齡開(kāi)始做陰道涂片檢查，觀察情期規(guī)律性。80日齡開(kāi)始逢發(fā)情期（陰道涂片出現(xiàn)團(tuán)塊或成片的角化細(xì)胞，可能有極少量的白細(xì)胞）處死，采集血清、卵巢、子宮等相關(guān)器官。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別記錄各組小鼠行為和情

4、期變化情況、卵巢、子宮等相關(guān)器官的重量極其器官系數(shù)，收集一側(cè)卵巢進(jìn)行組織學(xué)處理以觀察卵泡發(fā)育情況，另一側(cè)卵巢和腦組織測(cè)定NOS的水平.主要結(jié)果如下：
　　 丙烯酰胺對(duì)小鼠行為及體重、器官的影響：丙烯酰胺染毒后，小鼠體重隨染毒劑量增加增長(zhǎng)減慢，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)神經(jīng)麻痹和行動(dòng)障礙。對(duì)卵巢觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和20mg組小鼠卵巢內(nèi)出現(xiàn)排卵黃體，40mg組小鼠卵巢細(xì)小，無(wú)黃體生成，對(duì)相關(guān)器官稱(chēng)重發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺主要使卵巢、子宮等生殖器官的臟器系數(shù)顯

5、著下降(P＜0.01).
　　 通過(guò)觀察陰道涂片，并將各段時(shí)期所占的比率（情期百分?jǐn)?shù)）進(jìn)行分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20mg組發(fā)情前期(P)和發(fā)情后期(M)的時(shí)間極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),而發(fā)情期(E)的時(shí)間極顯著的低于對(duì)照組(P＜0.01)；另外還發(fā)現(xiàn)20mg組小鼠出現(xiàn)間歇發(fā)情（發(fā)情后直接經(jīng)過(guò)發(fā)情后期又再次發(fā)情，沒(méi)有間情期出現(xiàn)）；40mg組的發(fā)情前期(P)、發(fā)情期(E)、發(fā)情后期(M)的時(shí)間極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，間

6、情期(D)較對(duì)照組顯著增大，并且實(shí)驗(yàn)后期40mg組小鼠出現(xiàn)長(zhǎng)期乏情，陰道涂片檢測(cè)都為間情期(D).
　　 對(duì)各組小鼠卵巢切片HE染色，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察識(shí)別并計(jì)出黃體數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠卵巢體積都大于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組卵巢的黃體數(shù)目極顯著高于20mg組小鼠(P＜0.01)；40mg組小鼠卵巢卵泡多停留在有腔卵泡期，都沒(méi)有黃體出現(xiàn)。
　　 對(duì)各組小鼠的血清雌激素和孕激素水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨丙烯酰胺劑量的增加小鼠血清雌激

7、素水平逐漸升高(P＞0.05)；而小鼠血清中孕酮水平顯著下降(P＜0.01)。
　　 使用卵巢5％勻漿液，離心取上清測(cè)定小鼠卵巢中一氧化氮合酶的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著染毒劑量的增高卵巢組織中TNOS，及兩種分型iNOS和cNOS水平呈升高趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較存在極顯著差異(P＜0.01),40mg組與20mg組比較也存在極顯著差異(P＜0.01)。
　　 丙烯酰胺對(duì)小鼠腦組織NOS水平的影響：使用腦組織10％勻漿液，離心

8、取上清測(cè)定小鼠卵巢中一氧化氮合酶的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20mg組與對(duì)照組比較TNOS水平顯著性的下降(P＜0.01)，而40mg組與對(duì)照組和20mg組比較TNOS水平顯著性的上升。對(duì)兩種分型NOS的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著染毒劑量的增高腦組織中iNOS水平呈升高趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及兩實(shí)驗(yàn)組間比較存在極顯著差異(P＜0.01)；而對(duì)cNOS測(cè)定發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較cNOS水平都顯著性的下降(P＜0.01)，但是40mg組與20mg組比較cNOS水

9、平卻出現(xiàn)升高(P＜0.01)。另外發(fā)現(xiàn)cNOS的表達(dá)與iNOS的表達(dá)之間可能存在拮抗關(guān)系。
　　 以上研究表明丙烯酸胺對(duì)雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，影響雌性動(dòng)物發(fā)情、卵泡發(fā)育和排卵。丙烯酰胺可能通過(guò)影響小鼠腦組織中NOS的分泌，進(jìn)而影響腦組織特定局部的NO含量，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)雌性動(dòng)物生殖機(jī)能產(chǎn)生毒性的。
　　 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)在氧氣存在下能催化精氨酸分解生

10、成一氧化氮(nitric oxide， NO)，同時(shí)產(chǎn)生L-瓜氨酸。NOS有以下幾種形式：神經(jīng)型NOS(neuronal NOS, nNOS，又稱(chēng)Ⅰ型NOS)、誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS, iNOS，又稱(chēng)Ⅱ型NOS)、內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS, eNOS，又稱(chēng)Ⅲ型NOS)，其中nNOS和eNOS又被稱(chēng)為組成型NOS(constitutive NOS， cNOS)。cNOS為Ca2+依賴(lài)型，主要位于內(nèi)皮細(xì)

11、胞(eNOS)及腦(nNOS);iNOS為非Ca2+依賴(lài)型，主要位于巨噬細(xì)胞、嗜中性白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞。
　　 研究已發(fā)現(xiàn)多種不同分型的NOS在雌性生殖器官（如卵巢、陰道、輸卵管）中有表達(dá)，并在生殖生理方面發(fā)揮著重要的作用。過(guò)去已有關(guān)于iNOS和eNOS在卵巢中表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)iNOS主要在卵母細(xì)胞，顆粒細(xì)胞和黃體中表達(dá)，而eNOS主要在卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和黃體細(xì)胞中表達(dá)。最近的研究表明在非神經(jīng)細(xì)胞中，如巨噬細(xì)

12、胞也有nNOS表達(dá)，說(shuō)明nNOS可能和eNOS、iNOS-樣都參與卵巢的生理過(guò)程。但至今未見(jiàn)到關(guān)于小鼠卵巢中nNOS表達(dá)的報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)的目的就是研究nNOS在小鼠卵巢中不同卵泡發(fā)育階段的表達(dá)與定位情況。
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：nNOS在小鼠卵巢的各級(jí)卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，次級(jí)卵泡、有腔卵泡和閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞(GC)的細(xì)胞質(zhì)存在特異性表達(dá)，剛排卵形成的黃體(CL)中也有弱表達(dá)，而在原始卵泡周?chē)谋馄筋w粒細(xì)胞、早期柱狀顆