聚肌胞合成條件的優(yōu)化及其抗病毒作用的研究.pdf

1、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid，polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通過堿基互補配對形成的雙鏈RNA，是一種高效干擾素誘導(dǎo)劑。本研究利用國產(chǎn)原料首先對聚肌胞的合成條件進行了優(yōu)化，探討了影響聚肌胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素。為探討聚肌胞對特異性免疫的影響，本文研究了新城疫免疫前后不同時間應(yīng)用聚肌胞對雛雞抗體水平的影響。為探討聚肌胞在魚類中的抗病毒作用，研究了聚肌胞對患有淋巴囊腫病毒病牙鲆的初步療效;探討了聚

2、肌胞的抗病毒機制，實驗進一步對聚肌胞不同用藥途徑誘導(dǎo)大菱鲆抗病毒蛋白Mx轉(zhuǎn)錄水平的時相變化以及血液天然免疫相關(guān)指標的變化進行了較深入的研究。研究結(jié)果如下:
　　 1.聚肌苷酸與聚胞苷酸合成聚肌胞的最適條件為:磷酸緩沖液(pH7.2)或Tris-HCl緩沖液(pH7.2)可以提供聚肌胞穩(wěn)定的pH環(huán)境，聚肌苷酸和聚胞苷酸在45℃條件下退火，并在100℃煮沸滅菌30min后采取水流迅速降溫復(fù)性形成的聚肌胞減色效應(yīng)顯著，適當(dāng)增加金屬離子

3、(Na+，Ca2+)溶液的濃度可以增強聚肌胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。聚肌苷酸受Na+的影響顯著并且可以被溴化乙啶染色，表明聚肌苷酸溶液具有自身可以配對形成雙鏈的結(jié)構(gòu)特點;聚胞苷酸不具備雙鏈結(jié)構(gòu)的特點;Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Na+在一定濃度范圍內(nèi)可以明顯提高聚肌胞雙鏈的結(jié)合緊密度，而Cu2+對聚肌胞雙鏈結(jié)構(gòu)具有破壞作用;硫酸卡那霉素和鈣離子可以保護聚肌胞抵抗RNA酶迅速降解的作用;實驗發(fā)現(xiàn)了不同動物的血清中RNA酶活性對聚肌胞的降

4、解作用有差異，其中，雞血清對聚肌胞的降解最明顯，而兔血清對聚肌胞降解不明顯;聚肌胞的瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，聚肌胞的遷移率與100bp的Marker基本一致，Ca2+和硫酸卡那霉素對聚肌胞的電泳遷移率沒有影響。聚肌胞的性質(zhì)及其穩(wěn)定性的研究為開發(fā)價廉有效的新型抗病毒藥物提供了工藝參數(shù)基礎(chǔ)。
　　 2.聚肌胞聯(lián)合新城疫疫苗可以提高雛雞血清中的免疫抗體滴度。免疫之前48h、24h和12h注射polyI:C，雛雞血液中抗體效價僅在10日齡明

5、顯升高;免疫新城疫疫苗的同時及免疫之后12h、24h注射polyI:C，9～12日齡雛雞血清抗體滴度均明顯提高。PolyI:C可以提高雛雞免疫抗體滴度，對由弱毒苗刺激的免疫反應(yīng)具有調(diào)理作用。實驗結(jié)果為干擾素誘導(dǎo)劑與弱毒疫苗的聯(lián)合應(yīng)用提供了重要的試驗參考。
　　 3.本研究利用聚肌胞對患有淋巴囊腫病毒病的牙鲆進行了初步治療，發(fā)現(xiàn)聚肌胞能夠抑制淋巴囊腫病毒復(fù)制。聚肌胞對輕度患病牙鲆治療的10日內(nèi)發(fā)現(xiàn)，僅1尾牙鲆死亡，其中10尾魚的較

6、大腫瘤有明顯脫落現(xiàn)象;而對患病較重的牙鲆治療后發(fā)現(xiàn)，囊腫脫落效果不明顯，但囊腫也不增多，死亡率為16％左右，對照組死亡率達到40％。對患有淋巴囊腫病毒病的牙鲆組織器官的石蠟切片顯示，囊腫塊內(nèi)具有明顯的肥大細胞;在肉瘤根部的上皮組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了許多比正常上皮細胞大數(shù)十倍的肥大細胞;鰓絲部位有明顯顆粒狀聚集體，疑似病毒包涵體聚集體。本實驗首次使用聚聚肌胞在水產(chǎn)養(yǎng)殖上進行臨床應(yīng)用，并取得了一定的治療效果，這將為困擾了水產(chǎn)業(yè)多年的病毒病的治療提供依

7、據(jù)。
　　 4.聚肌胞腹腔注射，浸泡和投喂等三種用藥方式對大菱鲆血清中的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性有一定的影響，對血清溶菌酶活性的影響不顯著，注射聚肌胞后大菱鲆血液細胞中的白細胞比例有升高趨勢，但與用藥前相比差異不顯著。在分子水平上，本試驗利用軟件對大菱鲆Mx基因進行了分析，利用Mx基因保守區(qū)自行設(shè)計的引物擴增片段特異性較高，初步建立了半定量RT-PCR法檢測Mx基因的表達;三種用藥途徑誘導(dǎo)Mx轉(zhuǎn)錄水平的時相變化發(fā)現(xiàn)，三種途徑均