內(nèi)源性抗菌肽基因的過(guò)量表達(dá)對(duì)家蠶抗病力影響的研究.pdf

1、昆蟲(chóng)抗菌肽是昆蟲(chóng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的一系列小分子多肽，對(duì)昆蟲(chóng)的抗病能力起著重要的作用。昆蟲(chóng)抗菌肽具有殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣等特點(diǎn)，而引起人們的普遍關(guān)注。家蠶作為支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，因此提高其抗病性的研究對(duì)提高蠶絲生產(chǎn)有著重要的意義。家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)中的模式生物，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)對(duì)家蠶的抗菌肽做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)家蠶中存Cecropin、Moricin、Attacin、Defencin、Gloverin、Lebocin這六大類抗菌肽基

2、因，這些基因?qū)倚Q的抗病能力應(yīng)該發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段培育抗病性強(qiáng)的新品種成為新的育種研究方向，人們把昆蟲(chóng)抗菌肽基因?qū)雱?dòng)植物染色體，已經(jīng)獲得了抗病性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，為選育高抗性的動(dòng)植物品種作出了重要的探索。 本研究基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺(tái)，選擇對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌有抗菌活性的家蠶Moricin2基因(NCBI LOCUS:AB006915.1)和對(duì)革蘭氏陰性菌有抗

3、菌活性的家蠶Lebocin3基因(NCBI LOCUS:AB003035)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體并導(dǎo)入家蠶基因組中，探索轉(zhuǎn)內(nèi)源性抗菌肽基因后對(duì)家蠶抗菌能力和生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本研究獲得的如下結(jié)果： 1.抗菌肽轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將主要在家蠶脂肪體表達(dá)的SDH啟動(dòng)子與Morcin2基因構(gòu)建成融合轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac[3×P3-EGFP+SDH-Mor]；將Lebocin3基因分別與SDH啟動(dòng)子或在家蠶全身廣譜表達(dá)的IE1啟

4、動(dòng)子構(gòu)建成兩個(gè)融合轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，即pBac[3×P3-DsRed+IE1-Leb]和pBac[3×P3-DsRed+SDH-Leb]。 2.轉(zhuǎn)基因蠶的制作與分子檢測(cè) 將構(gòu)建好的pBac[3×P3-EGFP+SDtt-Mor]、pBac[3×P3-DsRed+IE1-Leb]和pBac[3×P3-DsRed+SDH-Leb]3個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體通過(guò)蠶卵顯微注射后，在G1代進(jìn)行熒光篩選，分別得到40、30、36頭熒光蠶。

5、 對(duì)每個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因家蠶品系隨機(jī)抽取一個(gè)個(gè)體進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，分析結(jié)果表明，目的基因表達(dá)盒都已經(jīng)整合到家蠶基因組上，即成功構(gòu)建了SDH-Mor、IE1-Leb和SDH-Leb轉(zhuǎn)基因系。 3.轉(zhuǎn)基因家蠶中Moricin2和Lebocin3抗菌肽基因的表達(dá)分析 抽提3個(gè)轉(zhuǎn)基因系和對(duì)照的脂肪體總RNA，合成cDNA后進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：(1)SDH-Mor和對(duì)照脂肪體中Moricin2基因

6、mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.72±0.018和0.43±0.0093，Moricin2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量提高差異極顯著；(2)IE1-Leb、SDH-Leb和對(duì)照脂肪體中Lebocin3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是0.73±0.015、0.71±0.017和0.42±0.0091，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系中Lebocin3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著提高，但是兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系間差異不顯著。 4.轉(zhuǎn)基因蠶的抗菌能力分析和生長(zhǎng)發(fā)育情況

7、觀察 對(duì)SDH-Mor轉(zhuǎn)基因系和對(duì)照2齡起蠶添食蘇云金芽孢桿菌，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)蘇云金芽孢桿菌濃度為1.25×108個(gè)/mL，時(shí)，SDH-Mor轉(zhuǎn)基因系比對(duì)照對(duì)蘇云金芽孢桿菌的抗性提高了約24.4％。 對(duì)IE1-Leb轉(zhuǎn)基因系和SDH-Leb轉(zhuǎn)基因系與對(duì)照2齡起蠶添食E.coli，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)E.col濃度為1.4×109個(gè)/mL時(shí)，IE1-Leb轉(zhuǎn)基因系和SDH-Leb轉(zhuǎn)基因系對(duì)E.coli的抗性比對(duì)照分別提高了約