基于微流控技術(shù)的環(huán)境中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是環(huán)境微生物的一種，廣泛的存在于自然界中。少量的金黃色葡萄球菌不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生影響，是正常的生物群落組成部分之一。但當(dāng)其所在的環(huán)境適合其生長(zhǎng)時(shí)，金黃色葡萄球菌將會(huì)大量繁殖，對(duì)該環(huán)境造成污染，并通過(guò)空氣、水等介質(zhì)傳播，感染其中生物，導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生，嚴(yán)重威脅到該環(huán)境中的其他生物健康，引發(fā)多種疾病甚至導(dǎo)致死亡，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。金黃色葡萄球菌很容易隨著水體、空氣進(jìn)入人體中大量繁殖，產(chǎn)生腸毒素。引起惡心、嘔吐、胃痙攣和腹瀉等中

2、毒癥狀，其中免疫力低下的人群如兒童和老年人其受感染，將會(huì)導(dǎo)致感染性休克或多器官功能衰竭，嚴(yán)重的可能導(dǎo)致死亡。不僅如此，金黃色葡萄球菌在傳播污染過(guò)程中極容易發(fā)生變異產(chǎn)生耐藥基因，引發(fā)嚴(yán)重的生物安全問(wèn)題。
　　因此，檢測(cè)金黃色葡萄球菌的濃度變化，對(duì)保障環(huán)境安全以及避免環(huán)境遭受大面積的金黃色葡萄球菌污染、保障人類健康、及時(shí)有效的進(jìn)行生物安全的防控以及環(huán)境預(yù)警等，都具有重大意義。目前有很多學(xué)者對(duì)環(huán)境類樣本中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究、檢測(cè)，

3、但是所用的方法大多為培養(yǎng)法。金黃色葡萄球菌作為生物性污染物的一種，有著能夠在短時(shí)間內(nèi)自我生長(zhǎng)、繁殖的特點(diǎn)。不同時(shí)間對(duì)同一份環(huán)境樣本中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果數(shù)值有著巨大的差異。因此，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速在線實(shí)時(shí)分析的需求日益緊迫。
　　微流控技術(shù)是一種新興的技術(shù)，能夠?qū)⒍喾N反應(yīng)集成到一塊幾個(gè)平方厘米的芯片上完成，由于其效率高、成本低、分析時(shí)間短，并且能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、樣本結(jié)果一體化(Sample to answer)、便

4、攜化檢測(cè)，逐漸為了最佳的污染物檢測(cè)技術(shù)之一。
　　在本論文中，建立了兩類微流控體系，即分別為微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)檢測(cè)體系以及微流控—免疫檢測(cè)體系，均能夠?qū)瘘S色葡萄球菌進(jìn)行高效、快速、準(zhǔn)確、低成本的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
　　在微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)體系的建立中，首先設(shè)計(jì)并篩選出了一套能夠針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因進(jìn)行擴(kuò)增的引物，建立了一個(gè)

5、宏觀的金黃色葡萄球菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)體系，并用13種其他細(xì)菌作為陰性對(duì)照，對(duì)該體系的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。然后將這個(gè)穩(wěn)定的、高特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系整合在了微流控芯片中。所形成的微流控—LAMP體系將樣品的處理、金黃色葡萄球菌DNA的釋放、擴(kuò)增以及結(jié)果的觀察集成在了一個(gè)長(zhǎng)寬均為厘米級(jí)別的芯片中，能夠在一個(gè)小時(shí)左右，同時(shí)完成對(duì)4個(gè)樣本檢測(cè)。在將宏觀狀態(tài)下的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增金黃色葡萄球菌檢測(cè)體系整合在微米級(jí)的管道中的同時(shí)，將整個(gè)反應(yīng)體系從25

6、μL縮小到了1.5μL，因此采用此體系進(jìn)行檢測(cè)大大減少了對(duì)試劑量的需求，同時(shí)也相應(yīng)的減少了對(duì)樣本量的需求。本體系檢測(cè)限為10個(gè)DNA拷貝，比PCR反應(yīng)低12個(gè)數(shù)量級(jí)。反應(yīng)結(jié)果在365nm的紫外線下清晰可見(jiàn)。并且通過(guò)對(duì)芯片結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，使得芯片體系制作簡(jiǎn)單、容易操作，可以整合在便攜式、自動(dòng)化的系統(tǒng)中。在實(shí)際應(yīng)用中，可以實(shí)現(xiàn)直接在樣品采集地對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，免去了樣本運(yùn)送的麻煩。為驗(yàn)證本體系的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，用此體系檢測(cè)了24例實(shí)際樣本，并與傳

7、統(tǒng)的培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比。采用本體系實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌的濃度，可以有效的避免其對(duì)所在的環(huán)境造成大規(guī)模污染，對(duì)環(huán)境中的金黃色葡萄球菌的防治起到了積極作用，保障人類健康不受其威脅，應(yīng)用前景較為廣泛。為了適應(yīng)大量樣本的檢測(cè)，在本研究中對(duì)上述的微流控—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，優(yōu)化的體系可以同時(shí)檢測(cè)12個(gè)樣本。并且通過(guò)對(duì)芯片設(shè)計(jì)的優(yōu)化，使得操作更為簡(jiǎn)單、方便。使用本體系對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，降低了檢測(cè)成本以及試劑需求量，大大簡(jiǎn)化了制作

8、過(guò)程以及操作過(guò)程，可以整合在便攜式、自動(dòng)化的系統(tǒng)中
　　本論文還建立了一個(gè)微流控—免疫反應(yīng)體系，可以在同一個(gè)體系中同時(shí)完成對(duì)8個(gè)樣品的檢測(cè)，所需時(shí)間不超過(guò)40min，并且驗(yàn)證了芯片的特異性。相對(duì)于宏觀的檢測(cè)方法，本體系大大降低了樣本的檢測(cè)成本以及檢測(cè)時(shí)間。并且將檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)化了以后，將能夠適用于在采樣現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。通過(guò)熒光強(qiáng)度的分析，可以定量的檢測(cè)樣本中金黃色葡萄球菌的濃度，進(jìn)行簡(jiǎn)單的環(huán)境學(xué)分析。通過(guò)利用本體系對(duì)實(shí)際樣本進(jìn)行了

9、檢測(cè)，并用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法做對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證了該體系的可行性和穩(wěn)定性。該方法可以用于檢測(cè)養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中金黃色葡萄球菌，為廢水處理方法的選擇提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。本系統(tǒng)通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)廢水中金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)，在控制其對(duì)環(huán)境中水體、土壤以及禽畜之間的污染起到了積極作用。
　　本論文中所建立的兩個(gè)體系，原理不同，方式不同，但是均可以快速、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的、特異性的檢測(cè)金黃色葡萄球菌。可以用兩種體系對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，相互進(jìn)行