人工感染3種致病弧菌對(duì)大黃魚7種酶活性的影響【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　人工感染3種致病弧菌對(duì)大黃魚7種酶活性的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　目錄

3、 </p><p>　　摘要（Abstract） </p><p>　　1.引言...............................

4、...........................................................................................................................................1 </p><p>　　2.材料與方法..............................................

5、................................................................................................................2 </p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料............................................................................

6、...........................................................................2</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚...............................................................................................................

7、............................2</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株...........................................................................................................................................2</p><p&

8、gt;　　2.1.3 試劑...................................................................................................................................................2</p><p>　　2.1.4 儀器............................

9、.......................................................................................................................2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法.....................................................................

10、.................................................................................2</p><p>　　2.2.1 各菌株感染濃度的確定...................................................................................................

11、................2</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組...........................................................................................................................................3</p><p>　　2.2.3 菌

12、懸液的配置...................................................................................................................................3</p><p>　　2.2.4 人工感染..................................................

13、.........................................................................................3</p><p>　　2.2.5 樣品采集.................................................................................................

14、..........................................3</p><p>　　2.2.6 血清溶菌酶活性測(cè)定.......................................................................................................................3</p><p&g

15、t;　　2.2.7 血清酚氧化酶活性的測(cè)定...............................................................................................................3</p><p>　　2.2.8 血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的測(cè)定................................

16、.....................................3</p><p>　　2.2.9 數(shù)據(jù)處理...........................................................................................................................................4</p>

17、;<p>　　3.結(jié)果和分析............................................................................................................................................................4</p><p>　　3.1 血清溶菌酶（LSZ)活性變化.

18、....................................................................................................................4</p><p>　　3.2 血清酚氧化酶(PO)活性變化..............................................................

19、........................................................4</p><p>　　3.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性變化.......................................................................................................5</p>&l

20、t;p>　　3.4 血清酸性磷酸酶(ACP)活性變化...............................................................................................................5</p><p>　　3.5 血清堿性磷酸酶(AKP)活性變化....................................

21、...........................................................................6</p><p>　　3.6 血清髓過氧化物酶(MPO)活性變化....................................................................................................

22、......7</p><p>　　3.7 血清過氧化物酶(POD)活性變化...............................................................................................................7</p><p>　　4.討論...............................

23、..........................................................................................................................................7</p><p>　　5.結(jié)論與展望...................................................

24、..........................................................................................................9</p><p>　　致謝........................................................................................

25、....................................................................................9</p><p>　　參考文獻(xiàn)............................................................................................................

26、......................................................10</p><p>　　摘要：目前頻發(fā)的大黃魚潰瘍病主要由溶藻弧菌、哈維氏弧菌以及副溶血弧菌引起。本實(shí)驗(yàn)將健康的大黃魚分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，分別注射0.2 ml的哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及滅菌生理鹽水，并在人工感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20 d分別采樣，通過測(cè)定每組大黃魚

27、血清中7種免疫相關(guān)酶活性，比較這3種致病弧菌毒性差異及對(duì)大黃魚非特異性免疫功能的影響。結(jié)果顯示：在感染后的1～10 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大黃魚血清中LSZ、ACP、POD、MPO的活性變化，總體表現(xiàn)為先升高、后降低再逐漸升高最后趨于一致的現(xiàn)象，且不同病原菌之間存在一定的時(shí)效差異。 AKP、PO、SOD和LSZ對(duì)入侵體內(nèi)的哈氏弧菌反應(yīng)較敏感，ACP、SOD、POD和MPO對(duì)入侵體內(nèi)的溶藻弧菌反應(yīng)較敏感，LSZ、ACP和PO對(duì)入侵體內(nèi)的副溶血弧

28、菌反應(yīng)較敏感。</p><p>　　關(guān)鍵詞：大黃魚； 溶藻弧菌； 哈維氏弧菌； 副溶血弧菌； 酶活性</p><p>　　Effects of experimental infection with three pathogenic vibrio on seven enzymes in Pseudosciaena crocea（Richardson）</p><p&g

29、t;　　Abstract: The ulcer disease ,widely spread on the large yellow croaker ,is mainly caused by Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus according to the researches. In this paper , we set 3 exper

30、imental groups with the injection of 0.2 ml Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus, respectively, while injecting the same dose of sterile saline for the control group. Then Sampled at 0,1,2,4,7

31、,10,13,16 and 20 days after infection. By measuring the activity</p><p>　　1 引言 大黃魚Pseudosciaena crocea（Richardson）隸屬鱸行目，石首魚科，黃魚屬，俗稱黃魚、黃瓜魚、黃花魚，是我國主要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一。隨著大黃魚人工育苗技術(shù)的完善，其養(yǎng)殖規(guī)模也迅速擴(kuò)大，但由于養(yǎng)殖密度的加大及日常不科學(xué)的管理措施

32、，疾病的流行和危害也日益嚴(yán)重，威脅著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。這包括長期近親繁殖導(dǎo)致種質(zhì)的退化，病害防治用藥上有些養(yǎng)殖戶或一些漁病防治員為了快速治好魚病或?yàn)榱速嶅X, 不顧農(nóng)業(yè)部頒布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理規(guī)定》(31號(hào)令) , 未確定病原或病因而盲目大量使用禁用漁藥或抗生素等, 甚至使用人用的新藥, 形成濫用漁藥的局面，都加大了病害發(fā)生率。 目前已鑒定出的大黃魚細(xì)菌性病原有溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶

33、血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、鰻弧菌（V.anguillarum）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、河流弧菌（V.fluvialis）、腐敗假單胞菌（Pseudomonas putrefaciens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas </p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><

34、;b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚</p><p>　　大黃魚來自浙江寧波象山黃避岙養(yǎng)殖海區(qū)，選擇體表無明顯傷痕，體重250～300 g之間，攝食正常的健康大黃魚。</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株</p><p>　　哈維氏弧菌(V.harveyi)、溶藻弧菌(V.algi

35、nolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等菌株，均分離自患病大黃魚，并經(jīng)回歸感染試驗(yàn)證明具有較強(qiáng)毒力(金 珊，2005)，保存于本實(shí)驗(yàn)室。溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)購置sigma公司。</p><p><b>　　2.1.3 試劑</b></p><p>　　L-多巴(上海伯奧生物科技公司)<

36、/p><p><b>　　2.1.4 儀器</b></p><p>　　電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082型)；sunrise吸光酶標(biāo)儀；恒溫水浴鍋；紫外分光光度計(jì)。</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 各菌株感染濃度的確定</p><

37、p>　　將保存的哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28 °C恒溫培養(yǎng)24 h后，用0.85%無菌生理鹽水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計(jì)數(shù)，最終采用平板傾注法計(jì)數(shù)活菌數(shù)。將各種菌液濃度調(diào)整至109 CFU·ml-1左右，再稀釋成106，107，108 3個(gè)梯度的菌懸液，備用。將健康大黃魚隨機(jī)分為4組，每組10尾，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組分別腹腔注射上述備用的106，107，108 3個(gè)濃度的菌懸

38、液，每尾注射0.2 ml，Ⅳ組注射0.2 ml滅菌的生理鹽水。觀察注射后1～2周內(nèi)各感染組魚的死亡情況，最終確定試驗(yàn)時(shí)哈氏弧菌感染濃度為106 CFU·ml-1，溶藻弧菌和副溶血弧菌感染濃度為107 CFU·ml-1。</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組</p><p>　　購買的健康大黃魚隨機(jī)分成四組，放養(yǎng)于浙江省寧波市象山縣黃避岙海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚排，網(wǎng)箱規(guī)格3

39、m×3 m×3 m，試驗(yàn)期間水溫：(28±1) ℃，海水鹽度：28，每組放養(yǎng)80尾，正常投喂，暫養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　2.2.3 菌懸液的配置</p><p>　　(1) 50%海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取普通營養(yǎng)瓊脂商品培養(yǎng)基33 g，溶于500 ml蒸餾水中，加入500 ml陳海水，加熱攪拌，煮沸至完全溶解，在高壓蒸氣10549.86

40、 kg/m2 下滅菌20 min，最終pH為7.3±0.1，做無菌試驗(yàn)后備用。</p><p>　　(2) 菌液配制：將保存的哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28°C恒溫培養(yǎng)24 h后，用0.85%無菌生理鹽水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計(jì)數(shù)，調(diào)整哈氏弧菌菌液濃度至106 CFU·ml-1，調(diào)整溶藻弧菌和副溶血弧菌菌液濃度至107 CFU·ml-

41、1。</p><p>　　(3) 菌液濃度計(jì)算：采用平板傾注法，10倍稀釋各組菌懸液，分別吸取稀釋10-4、10-5和10-6的菌懸液進(jìn)行平板傾注，然后在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24~28 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算感染所用各種菌懸液的活菌濃度。</p><p>　　2.2.4 人工感染</p><p>　　大黃魚用丁香酚麻醉后，進(jìn)行腹腔注射感染，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別注射

42、哈氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血弧菌，每尾注射0.2 ml上述對(duì)應(yīng)菌懸液，對(duì)照組Ⅳ每尾注射0.2 ml滅菌的生理鹽水。試驗(yàn)期間各組大黃魚均未發(fā)生死亡現(xiàn)象。</p><p>　　2.2.5 樣品采集</p><p>　　在感染后第0 d，1 d，2 d，4 d，7 d，10 d，13 d，16 d，20 d分別從各感染組與對(duì)照組隨機(jī)各取6尾大黃魚，采用一次性注射器，尾靜脈取血，各組制備三個(gè)平行血

43、樣后進(jìn)行7種酶指標(biāo)檢測(cè)。</p><p>　　2.2.6 血清溶菌酶活性的測(cè)定</p><p>　　采用Hultmark等(1980)的方法：以溶壁微球菌為底物，將該菌用0.1 mol/L、pH 6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成A570≈0.3的菌懸液，取3.0 mL該菌懸液與200 μL待測(cè)血清于試管中混勻，于570 nm處測(cè)定其A0，然后將試管置于37℃水浴保溫30 min，然后取出立即置冰

44、浴中10 min以終止反應(yīng)，測(cè)定其A值，溶菌活力UL按下式計(jì)算：UL= (A0-A)/A.</p><p>　　2.2.7 血清酚氧化酶活性的測(cè)定</p><p>　　以L-多巴為特異性底物，采用改進(jìn)的Ashida等(1971)方法在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行。在96孔酶標(biāo)板中加入10 μl血清，然后向各孔中加入200 μl 0.1 mol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，最后向各樣品孔中加入10

45、μl的L-DOPA液(0.01 mol/L)，在酶標(biāo)儀中振蕩4次混勻，每隔4 min讀取490 nm處的吸光值(OD)。在該試驗(yàn)條件下，將每分鐘OD值增加0.001作為一個(gè)酶活力單位。</p><p>　　2.2.8 血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的測(cè)定</p><p>　　根據(jù)購自南京建成生物技術(shù)研究所的試劑盒，分別測(cè)定試驗(yàn)組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和對(duì)照組大黃魚血清中，髓過氧化物酶(

46、MPO)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超過氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的活性。</p><p>　　2.2.9 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　對(duì)于試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003軟件進(jìn)行整理和作圖；試驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；各組處理平均數(shù)之間采用LSD檢驗(yàn)方法進(jìn)行差異顯著性比較。</p><p>&l

47、t;b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 血清溶菌酶(LSZ)活性變化</p><p>　　血清溶菌酶活性變化趨勢(shì)見圖1。在感染后1 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而實(shí)驗(yàn)組Ⅲ與實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ之間均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。1～2 d內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組略有下降與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。2 d后，副溶

48、血弧菌感染組有較大上升趨勢(shì)，在第4 d極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ溶菌酶活力與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。10 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ有所下降與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，與實(shí)驗(yàn)組Ⅲ之間也存在顯著差異(P<0.05)。10 d以后變化趨勢(shì)不明顯。結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組之間，副溶血弧菌對(duì)大黃魚溶菌酶活性影響較為明顯。</p>&l

49、t;p>　　圖1 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清溶菌酶活性的影響</p><p>　　Fig. 1 Effects of three pathogenic vibrio on Lysozyme activity in P.crocea</p><p>　　注：圖中同組有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。</p>

50、;<p>　　3.2 血清酚氧化酶(PO)活性變化</p><p>　　血清酚氧化酶活性變化趨勢(shì)見圖2。1 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組酚氧化酶活性顯著上升與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ上升幅度最大，與實(shí)驗(yàn)組Ⅰ差異顯著(P<0.05)，與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ差異極顯著(P<0.01)。2 d時(shí)，各組酶活性下降明顯，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。4 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ持續(xù)下降，顯著低

51、于對(duì)照組(P<0.05)，與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ之間也存在顯著差異(P<0.05)。7 d以后各實(shí)驗(yàn)組酚氧化酶活性基本恢復(fù)正常，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示感染后血清酚氧化酶活性在1～4 d內(nèi)發(fā)生了明顯的變化，不同病原菌之間存在一定的時(shí)效差異。</p><p>　　圖2 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清酚氧化酶酶活性的影響</p><p>　　Fig. 2 Effect

52、s of three pathogenic vibrio on phenoloxidase activity in P.crocea</p><p>　　3.3 血清超氧化物岐化酶(SOD)活性變化 血清超氧化物歧化酶活性變化趨勢(shì)見圖3。1 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ超氧化物歧化酶活性降低，與實(shí)驗(yàn)組Ⅲ，對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。2 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異都不不顯著(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組

53、Ⅰ與Ⅱ之間存在顯著差異(P<0.05)。7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)?？傮w反應(yīng)各實(shí)驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性變化不顯著。</p><p>　　圖3 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清超氧化物岐化酶活性的影響</p><p>　　Fig. 3 Effects of three pathogenic vibrio on superoxide dismutase act

54、ivity in P.crocea</p><p>　　3.4 血清酸性磷酸酶(ACP)活性變化 血清酸性磷酸酶活性變化趨勢(shì)見圖4。1 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組血清酸性磷酸酶的活力下降，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。2 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ顯著上升，與對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅲ都存在極顯著差異(P<0.01)。4 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。7 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組都有所下降，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ極顯

55、著低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。10 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅲ顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組Ⅱ顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。13 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅲ活性上升。13 d以后，各組水平基本趨于一致。結(jié)果反應(yīng)溶藻弧菌對(duì)酸性磷酸酶活性的影響最為明顯。</p><p>　　圖4 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清酸性磷酸酶活性的影響Fig. 4

56、Effects of three pathogenic vibrio on acid phosphatase activity in P.crocea</p><p>　　3.5 血清堿性磷酸酶（AKP)活性變化</p><p>　　堿性磷酸酶活性變化趨勢(shì)見圖5。1 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ堿性磷酸酶活性顯著低于實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ和對(duì)照組(P<0.05)。2 d時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均不顯著(P&

57、gt;0.05)。4 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ明顯上升與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ也存在極顯著差異(P<0.01)。7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ極顯著低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ(P<0.01)。10 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ下降趨勢(shì)明顯，與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ均存在顯著差異(P<0.05)。10 d以后各實(shí)驗(yàn)組之間無顯著差異。結(jié)果顯示3種致病細(xì)菌對(duì)大黃魚血清堿性磷酸酶的活性變化存在較大差異。</p><

58、p>　　圖5 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清堿性磷酸酶活性的影響</p><p>　　Fig. 5 Effects of three pathogenic vibrio on alkaline phosphatase activity in P.crocea</p><p>　　3.6 血清髓過氧化物酶(MPO)活性變化</p><p>　　血清髓過氧化物酶

59、活性變化趨勢(shì)見圖6。實(shí)驗(yàn)組Ⅰ在感染后1～2 d內(nèi)，髓過氧化物酶活性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，4 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，7 d后與對(duì)照組基本保持一致。實(shí)驗(yàn)組Ⅱ在感染后1～10 d內(nèi)，髓過氧化物酶活性變化較為明顯，主要呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第1 d、4 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在第2 d、7 d極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，第10 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，1

60、0 d以后與對(duì)照組差異不顯著。實(shí)驗(yàn)組Ⅲ髓過氧化物酶活性變化不明顯，與對(duì)照組差異不顯著。</p><p>　　圖6 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清髓過氧化物酶活性的影響 </p><p>　　Fig. 6 Effects of three pathogenic vibrio on myeloperoxidase activity in P.crocea</p><p

61、>　　3.7 血清過氧化物酶(POD)活性變化</p><p>　　血清過氧化物酶活性變化趨勢(shì)見圖7。1 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ過氧化物酶活性降低，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，與實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ存在極顯著差異(P<0.01)。2 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅲ活性明顯降低，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。4 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ顯著高于實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)

62、。7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ顯著低于實(shí)驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)。10 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅲ(P<0.05)。13 d后各組水平基本趨于一致。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　魚體內(nèi)的酶主要分布于組織細(xì)胞中。在正常情況下，血清中酶活性較低且相對(duì)恒定。當(dāng)組織發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞中的一些酶會(huì)大量逸出進(jìn)入血淋巴導(dǎo)致血清

63、中酶活性發(fā)生改變。因此通過測(cè)定血清中酶的活性變化可以反映魚體的生理狀態(tài)。</p><p>　　酚氧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶等都是免疫酶，是評(píng)價(jià)魚類非特異性免疫能力的指標(biāo)。當(dāng)病原菌進(jìn)入魚體后，首先引起機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)。隨著吞噬細(xì)胞的吞噬作用，溶酶體分泌溶酶體酶，以防御病原菌對(duì)魚體的損傷。溶酶體酶主要包括溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)，這些酶在非特異性免疫應(yīng)答中起

64、著重要作用。</p><p>　　圖7 3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清過氧化物酶活性的影響 Fig. 7 Effects of three pathogenic vibrio on peroxidase activity in P.crocea</p><p>　　溶菌酶作為魚類重要的非特異性免疫因子，在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿起著重要作用(Christopher，2001)。溶菌

65、酶是一種能水解黏多糖的堿性酶，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的黏多糖，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、細(xì)菌內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡，起到防御的功能。因此對(duì)于抵抗各種病原體的侵襲、增強(qiáng)疾病的抵抗力方面具有重要意義(王宏田，2000)。孫峰等(2005)曾研究了人工感染嗜水氣單胞菌后鯽魚體內(nèi)溶菌酶活性的變化。該研究表明，機(jī)體在受到外來病原菌感染時(shí)，吞噬細(xì)胞能夠合成和釋放出更多的溶菌酶，提高了溶解病菌的能力。本實(shí)驗(yàn)中，大黃魚在感染3種致

66、病弧菌后的第1～7 d內(nèi)溶菌酶活性變化較為明顯，各實(shí)驗(yàn)組溶菌酶活性變化總體表現(xiàn)出先升高、后略有降低接著又逐漸升高最后趨于一致的趨勢(shì)。其主要原因可能是感染初期魚體受到病原菌的刺激導(dǎo)致一些免疫細(xì)胞的活性增加，以致分泌溶菌酶的能力增強(qiáng)，使血清中溶菌酶的濃度升高，從而增加了對(duì)病原菌的溶解能力；但隨著刺激的不斷增強(qiáng)，溶菌酶分泌受到抑制，活性有所降低；而隨著魚體自身免疫系統(tǒng)的不斷調(diào)節(jié)，溶菌酶活性又開始上升；第10 d以后溶菌酶活性變化不顯著，這可&

67、lt;/p><p>　　磷酸酶是動(dòng)物體內(nèi)普遍存在且與動(dòng)物生命活動(dòng)密切相關(guān)的酶系，它參與動(dòng)物體內(nèi)物質(zhì)的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)、生長分化、分泌等多種生理活動(dòng)。堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)也是溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用(肖克宇，2007)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組的大黃魚在感染后第2～13 d內(nèi)ACP活性變化較為明顯，主要呈現(xiàn)出先升高，后略有下降然后又逐漸升高的趨勢(shì)，與溶菌酶活性變化趨勢(shì)類似。其中溶

68、藻弧菌對(duì)大黃魚血清中ACP活性影響最顯著。3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清AKP活性變化主要表現(xiàn)為：哈氏弧菌感染組先下降后顯著上升，然后再有所下降之后變化不明顯，而溶藻弧菌感染組和副溶血弧菌感染組活性變化總體變現(xiàn)為不顯著。不同菌種對(duì)大黃魚酶的影響存在差異性：ACP活性變化對(duì)溶藻弧菌較為敏感，AKP活性變化對(duì)哈氏弧菌較為敏感。</p><p>　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是一種重要

69、的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子(O-2)的歧化作用，產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)和氧(O2)，促使機(jī)體自由基的形成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡。超氧化物歧化酶在對(duì)延緩機(jī)體衰老、防止生物大分子損傷等方面具有重要作用。此外，SOD還具有抗菌、抗病毒等效果。已有研究表明：SOD活性與生物免疫機(jī)能密切相關(guān)，對(duì)于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力及整個(gè)機(jī)體的免疫功能有重要作用(Zegers，1999)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組在感染后的1～2 d內(nèi)SOD活性有所下降。當(dāng)S

70、OD活性降低時(shí)，機(jī)體內(nèi)自由基等毒害物質(zhì)就會(huì)積累，細(xì)胞便可能受到損傷；2 d后SOD活性有所升高，但整體變化不明顯，說明3種致病弧菌對(duì)大黃魚超氧化物歧化酶活性影響不明顯。</p><p>　　過氧化物酶(POD)是一種氧化還原酶，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中。過氧化物酶體含有豐富的酶類，其主要作用是將過氧化氫等細(xì)胞毒性物質(zhì)分解，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。過氧化物酶體普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，尤其是在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞

71、中數(shù)量特別多，另外過氧化物酶體還具有解毒作用。髓過氧化物酶(MPO)是一種催化過氧化物還原的酶，通過將過氧化氫和氯離子變?yōu)榇温人醽淼挚雇鈦砦镔|(zhì)，對(duì)各種病原菌具有很強(qiáng)的功效。從某些方面來看，過氧化物酶與髓過氧化物酶具有相似的生化性質(zhì)，都有一定抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組血清中過氧化物酶活性的變化與髓過氧化物酶活性的變化也存在相似性。其影響主要發(fā)生在感染后的1～10 d，表現(xiàn)出先上升，后下降然后再有所上升的趨勢(shì)，說明大黃魚血清抗菌活性

72、隨感染時(shí)間的延長發(fā)生了一定變化。另外各實(shí)驗(yàn)組酶活性變化也存在差異性，溶藻弧菌對(duì)POD和MPO較為敏感，酶活性變化幅度較大。 </p><p>　　酚氧化酶(PO)是無脊椎動(dòng)物重要的非特異性免疫因子，從氧化酶原(proPO)被激活到產(chǎn)生黑色素這個(gè)過程中往往伴隨呼吸爆發(fā)(李國榮，2003)。在某些研究中發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶活性在病原菌物入侵時(shí)有所提高(簡紀(jì)常，2004；楊文鴿，2006；)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與之相符：各實(shí)

73、驗(yàn)組大黃魚血清中PO活性在感染初期顯著提高，增加了其免疫防御作用，而7 d以后各實(shí)驗(yàn)組酚氧化酶活性基本恢復(fù)正常。</p><p><b>　　5 結(jié)論與展望</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)首次比較了引起大黃魚潰瘍病的三種致病弧菌對(duì)其機(jī)體損傷的毒力差異，以及對(duì)大黃魚血清中7種免疫相關(guān)酶影響的差異性和相關(guān)性。</p><p>　　研究表明大黃魚

74、被感染后，血清中7種免疫酶活性的變化均主要發(fā)生在病原菌感染前期，說明非特異性免疫因子在感染的早期階段起主要作用。</p><p>　　3種致病弧菌對(duì)大黃魚血清中各種酶活性的影響也存在差異性：AKP、PO、SOD和LSZ對(duì)入侵體內(nèi)的哈氏弧菌反應(yīng)較敏感，ACP、SOD、POD和MPO對(duì)入侵體內(nèi)的溶藻弧菌反應(yīng)較敏感，LSZ、ACP和PO對(duì)入侵體內(nèi)的副溶血弧菌反應(yīng)較敏感。這些酶在魚體抗感染非特異性免疫的啟動(dòng)和效應(yīng)過程中發(fā)

75、揮積極作用，也為養(yǎng)殖大黃魚弧菌病早期檢測(cè)指標(biāo)的選擇提供了參考依據(jù)。</p><p>　　相信，隨著對(duì)各種致病菌的致病機(jī)理，病原來源、侵入途徑及對(duì)機(jī)體致病作用方式的更進(jìn)一步研究；同時(shí)對(duì)大黃魚免疫功能基礎(chǔ)研究的深入，特別是對(duì)大黃魚抗病原菌感染的免疫反應(yīng)機(jī)理的了解，能對(duì)其疾病防御提供重要的理論基礎(chǔ)，且為將來各類免疫增強(qiáng)劑的篩選以提高大黃魚自身免疫抗病力奠定基礎(chǔ)，這對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展和保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全都有重要

76、的意義。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳昌福,羅宇良,蔡冰,等.飼養(yǎng)水溫對(duì)草魚溶菌酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),1996,3(3):26-28.</p><p>　　[2] 簡紀(jì)常,吳灶和.大黃魚庫道蟲病的初步研究[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2003,23(1):29-34.</p>

77、<p>　　[3] 簡紀(jì)常,葉劍敏,吳灶和.溶藻弧菌脂多糖對(duì)石斑魚免疫功能的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2004,28(1):103-105.</p><p>　　[4] 金珊,王國良,趙青松,等.海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的流行病學(xué)研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(1):17 -19.</p><p>　　[5] 李國榮,張士璀,李紅巖,等.酚氧化酶研究概況Ⅰ－特性、功能、分

78、布和在胚胎發(fā)育中的變化[J]．海洋科學(xué),2003,27(4):4-8.</p><p>　　[6] 劉青,趙恒壽.魚類常用免疫指標(biāo)及其檢測(cè)技術(shù)[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2007,34(3):28-30.</p><p>　　[7] 蘇永全,張彩蘭,王軍,等,大黃魚養(yǎng)殖[M].北京:海洋出版社,2004:1-10.</p><p>　　[8] 孫峰,張煜,李立德,等.感染嗜

79、水氣單胞菌對(duì)鯽魚非特異性免疫功能的影響[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2005,35(5):815~818.</p><p>　　[9] 孫建和,嚴(yán)亞賢,陳懷青,等.鯽魚的細(xì)胞免疫應(yīng)答研究[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,16(2):89-91.</p><p>　　[10] 王國良,祝璟琳,金 珊.養(yǎng)殖大黃魚3種致病弧菌的分子鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析[J].海洋與湖沼,2008,39(2):162

80、-167.</p><p>　　[11] 王宏田,徐永立,張培軍,等.假雄牙鲆不同組織中溶菌酶比活性的研究[J].海洋科學(xué),2000,24(10):7-8.</p><p>　　[12] 王軍,鄢慶枇,蘇永全,等.免疫添加物對(duì)大黃魚血液白細(xì)胞數(shù)量及其吞噬功能的影響[J].海洋科學(xué), 2001,25(9): 44-46.</p><p>　　[13] 吳志鵬,王三英.

81、三聯(lián)疫苗對(duì)大黃魚常見細(xì)菌性疾病免疫保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究[J]．廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,43(1):115-118.</p><p>　　[14] 肖克宇,鄧時(shí)銘,向建國,等.水產(chǎn)動(dòng)物免疫與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2007:139-190.</p><p>　　[15] 薛飛,劉濤,周維仁,等.綠原酸對(duì)異育銀鯽血液非特異性免疫因子的影響[J].江西農(nóng)業(yè)科學(xué),2007, (2):

82、148-151.</p><p>　　[16] 鄢慶枇,蘇永全,王軍,等.口服免疫添加劑對(duì)養(yǎng)殖大黃魚免疫機(jī)能影響的初步研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)</p><p>　　版),2001,6(3):134-137.</p><p>　　[17] 楊文川,李立偉,石磊,等.福建海水養(yǎng)殖魚類寄生貝尼登蟲病原學(xué)研究[J].臺(tái)灣海峽,2001,20(2): 205-20

83、9.</p><p>　　[18] 楊文鴿,黃曉春,李花霞,等.葡聚糖與其羧甲基衍生物對(duì)養(yǎng)殖大黃魚非特異免疫作用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,18(1):16-20.</p><p>　　[19] 張輝,張海蓮.堿性磷酸酶在水產(chǎn)動(dòng)物中的作用[J].河北漁業(yè), 2003(5): 12-13.</p><p>　　[20] 鄭天倫,王國良,黃家慶,等.養(yǎng)殖大黃魚潰瘍病

84、的病原菌及其防治藥物[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2006,33(5):573-577.</p><p>　　[21] 鄭天倫,王國良,金珊.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚弧菌病的中草藥防治[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(2):24-25.</p><p>　　[22] Chen X H, Lin K B, Wang X W. Outbreaks of an iridovius disease in

85、maricultured large yellow croaker,Pseudosciaena </p><p>　　crocea（Richardson）,in china[J].J Fish Dis,2003,26:615-619.</p><p>　　[23] Christopher J Bayne, Lena Gerwick. The acute phase response an

86、d innate immunity of fish [J]. Developmental and Comparative </p><p>　　Immunology, 2001, (25): 725-743. </p><p>　　[24] Zegers N, Kluter E, Van derStap E, et al. Expression of the protective ant