南極中山站周邊沙土中細(xì)菌耐藥圖譜及其耐藥基因檢測(cè)【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）</p><p>　　論文題目：南極中山站周邊沙土中細(xì)菌耐藥圖譜及其耐藥基因檢測(cè)</p><p>　　所在學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 環(huán)境工程 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào)

2、 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本論文在前期從南極沙土樣品分離到72株細(xì)菌，并檢測(cè)了對(duì)四環(huán)素類（四環(huán)素）和β-內(nèi)酰

3、胺類（頭孢哌酮、頭孢噻吩、頭孢孟多，青霉素G）的耐藥狀況的基礎(chǔ)上檢測(cè)各自耐藥基因型。本論文根據(jù)文獻(xiàn)合成了23種引物，利用PCR技術(shù)對(duì)已知耐藥表型的細(xì)菌進(jìn)行耐藥基因類型檢測(cè)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增檢測(cè)，對(duì)陽性反應(yīng)產(chǎn)物回收、克隆測(cè)序獲得片段序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果與已知耐藥基因序列比對(duì)分析最終確定耐藥基因型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，耐四環(huán)素基因型共13株菌，在利用所有引物公獲得結(jié)果231個(gè)，其中陽性結(jié)果19個(gè)，最終檢測(cè)序列比對(duì)分析得到9株細(xì)菌的耐藥基因型，分別是T

4、ET（B）型6株、TET(Q)型2株，TET（W）型1株；耐氨芐青霉素基因型共41株，共利用3對(duì)引物獲得結(jié)果68個(gè)，其中陽性結(jié)果22個(gè)，確定SHV型18株。該研究結(jié)果為研究人類活動(dòng)對(duì)南極環(huán)境的影響及耐藥基因在南極沙土中分布和傳播奠定了基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：耐藥性；耐藥基因；南極；細(xì)菌</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p>

5、;<p>　　The basis of drug resistance of this thesis in the earlyseparation of sand samples from the Antarctic to 72 bacteriaand detection of tetracyclines (tetracycline) and beta-lactams(cefoperazone, cephalothin,

6、cefamandole, penicillin G)detected on the respective resistant genotype.This thesis,the 23 kinds of primers were synthesized according to the literature, the type of resistance gene detection using PCRtechnology known dr

7、ug-resistant phenotype of bacteria, afterPCR amplification, the positive r</p><p>　　Key words: Resistance; Resistance gene;Antarctic; Bacteria;</p><p><b>　　目 錄</b></p><p&

8、gt;<b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 南極沙土中的細(xì)菌1</p><p>　　1.2 人類活動(dòng)對(duì)南極環(huán)境的影響1</p><p>　　1.3 極端環(huán)境耐藥基因的研究進(jìn)展2</p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p&g

9、t;　　2.1 樣品采集與儲(chǔ)運(yùn)2</p><p>　　2.2 材料與方法4</p><p>　　2.2.1 材料與試劑4</p><p>　　2.2.2 研究方案4</p><p><b>　　3 結(jié)果9</b></p><p>　　3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)、分離與純化9</p>

10、<p>　　3.2 耐藥性檢測(cè)10</p><p>　　3.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果10</p><p>　　3.3.1 耐四環(huán)素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果10</p><p>　　3.3.2 耐氨芐青霉素基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果12</p><p>　　3.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定14</p><p>　　3.

11、3.4 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果14</p><p>　　4 分析與討論17</p><p>　　4.1 三個(gè)站點(diǎn)細(xì)菌耐藥性的比較17</p><p>　　4.2 β-內(nèi)酰胺類耐藥細(xì)菌基因分析18</p><p>　　4.3 耐四環(huán)素類細(xì)菌基因型分析19</p><p>　　4.4 南極沙土中的細(xì)菌與其他陸源細(xì)菌耐藥基因

12、型的比較20</p><p><b>　　5 結(jié)論21</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)22</b></p><p><b>　　致 謝25</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>

13、;　　南極大陸又被稱為“第七大陸”，在地理位置上遠(yuǎn)離人類活動(dòng)區(qū)，是地球上受人類活動(dòng)影響最小的大陸。南極與北極、喜馬拉雅山并稱為世界三大極，三者均擁有全球最為極端的氣候和環(huán)境，其中南極具有極端寒冷、干燥、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)紫外線照射等特點(diǎn)，因此也被認(rèn)為是生命的一大禁區(qū)[1]。</p><p>　　1.1 南極沙土中的細(xì)菌</p><p>　　盡管南極大陸的這種惡劣環(huán)境對(duì)某些生物體而言是無法生存的，但是

14、對(duì)于另外一些生物來說它們卻對(duì)這種環(huán)境產(chǎn)生了適應(yīng)性，并且在這種環(huán)境脅迫和較強(qiáng)的選擇壓力下頑強(qiáng)的存活了下來[2]，正是因?yàn)槿绱嗽谀蠘O才有不同的生命形式和完整的生態(tài)系統(tǒng)存在。這些生物中有很大一部分是古老而且原始的原核生物——細(xì)菌，其中嗜冷和耐冷細(xì)菌尤為常見，它們?cè)谖镔|(zhì)和能量循環(huán)中也起到了至關(guān)重要的作用。</p><p>　　通過上述描述，我們可以看出無論是從生物學(xué)還是環(huán)境科學(xué)甚至能源利用的角度對(duì)南極沙土中的細(xì)菌進(jìn)行研究

15、都具有非常重要的意義和必要性。本研究選擇南極沙土中的細(xì)菌進(jìn)行研究也正是基于上述考慮。</p><p>　　1.2 人類活動(dòng)對(duì)南極環(huán)境的影響</p><p>　　人類活動(dòng)勢(shì)必會(huì)影響到南極脆弱的生態(tài)環(huán)境，對(duì)南極生物、環(huán)境以及人類活動(dòng)對(duì)南極沙土中微生物多樣性的影響研究，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有諸多報(bào)道。肖湘等人利用培養(yǎng)、DGGE、QC-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合研究了長(zhǎng)城站周邊土壤、湖水中細(xì)菌的多樣性，得

16、到了不同土壤環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群的區(qū)別，得到了可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)的方法測(cè)得的樣品中優(yōu)勢(shì)菌群的不同，分析了和人類活動(dòng)的關(guān)系[3]。Chong等人利用DGGE技術(shù)分析了澳大利亞Casey站周邊不同的8個(gè)具有代表型的沙土樣中的細(xì)菌多樣性的區(qū)別，并結(jié)合沙土樣的理化特征進(jìn)行了綜合分析，通過主成分分析法分析了TC、TN、水分、Cu、Fe、Zn等理化因子與微生物多樣性之間的關(guān)系[4]。Saul等通過培養(yǎng)和構(gòu)建16S rRNA文庫(kù)的方法系統(tǒng)研究了南極Ross灣

17、石油污染區(qū)土壤中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)石油污染區(qū)土壤中好氧菌數(shù)目增加1到2個(gè)數(shù)量級(jí)，主要以Pseudomonas, Sphingomonas 和Variovorax為優(yōu)勢(shì)菌群，但是多樣性會(huì)明顯減少[5]。以南極生態(tài)生態(tài)微生物多樣性變化為依據(jù)，研究其與人類在南極科考活動(dòng)的關(guān)系，在最近幾年，在南極大陸其他站點(diǎn)關(guān)于微生物多樣性的研究也有</p><p>　　1.3 極端環(huán)境耐藥基因的研究進(jìn)展</p><

18、p>　　抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里最重要的突破之一，它延長(zhǎng)了人類的平均壽命，使得細(xì)菌性疾病細(xì)菌不會(huì)像以往那樣對(duì)人類和動(dòng)物的健康甚至生命造成威脅。然而正是由于各類抗生素的發(fā)展和使用，使得部分細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，并通過脅迫和篩選作用將這種性狀保留下來。</p><p>　　國(guó)內(nèi)外研究人員也針對(duì)耐藥基因進(jìn)行了諸多研究。這些研究主要圍繞以下兩方面具體展開：（1）各種生態(tài)環(huán)境中耐藥基因的分布于與抗生素污染之間的關(guān)系

19、[6-7]；（2）極端環(huán)境中耐藥微生物和耐藥基因的多態(tài)性和進(jìn)化，進(jìn)而探討耐藥基因的起源[8-9]。Pruden等系統(tǒng)的研究了Colorado州不同環(huán)境中四環(huán)素類和磺胺類耐藥基因的分布狀況和趨勢(shì)，并首次明確提出了將耐藥基因作為新型環(huán)境污染物，拉開了生態(tài)環(huán)境耐藥基因的發(fā)現(xiàn)和生態(tài)功能研究的序幕[10]。Mindlin等從北極永凍土中分離到大量耐藥細(xì)菌，甚至分離到多重耐藥細(xì)菌，但是研究結(jié)果目前仍有爭(zhēng)議[11]。Allen等選擇了人跡罕至的Ala

20、skan永凍土作為研究對(duì)象，研究了其中β-內(nèi)酰胺類抗性基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了古老的β-內(nèi)酰胺類抗性基因[12]。D’Costa等在西伯利亞采集的3萬年前沉積物中發(fā)現(xiàn)ß-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、糖肽類抗性基因，并對(duì)其多態(tài)性和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)分析[13]。Knapp等對(duì)1940年至2008年間連續(xù)68年收集的土壤樣品進(jìn)行了各類抗性基因的定量檢測(cè)，為人類活動(dòng)對(duì)環(huán)境中微生物耐藥影響提供了佐證[14]。</p><p&g

21、t;　　關(guān)于南極環(huán)境中耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)已有部分報(bào)道[15-16]，而南極沙土環(huán)境中耐藥微生物及基因多樣性的研究尚未見報(bào)道。人類活動(dòng)對(duì)南極一定范圍內(nèi)的微生態(tài)影響已有報(bào)道，但是是否會(huì)影響南極沙土環(huán)境中的耐藥細(xì)菌和抗性基因的分布，尚未見報(bào)道，需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 樣品采集與儲(chǔ)運(yùn)</p&

22、gt;<p>　　實(shí)驗(yàn)所用沙土樣品（表1）由王佩兒老師參加澳大利亞南極2010/2011V1次科學(xué)考察（2010.10-2011.04）采集，樣品的采集得到中國(guó)極地考察辦公室和澳大利亞南極局的批準(zhǔn)，符合南極公約相關(guān)章程。沙土樣品均于現(xiàn)場(chǎng)用滅菌處理過的藥匙采集于已經(jīng)滅菌的專用袋中（Wendy，90×260mm），迅速置于攜帶的冰桶中，回到考察站后樣品轉(zhuǎn)移到-20℃冷藏庫(kù)保藏，回國(guó)途中保藏于雪龍船-20℃冷藏庫(kù)，運(yùn)回

23、實(shí)驗(yàn)室保藏與-20℃低溫冰箱。在轉(zhuǎn)運(yùn)途中利用冰袋和冷藏車確保低溫。各樣本的采集地點(diǎn)分布情況如圖1所示。</p><p>　　表1 采樣點(diǎn)具體說明</p><p><b>　　2.2 材料與方法</b></p><p>　　2.2.1 材料與試劑</p><p><b>　　（1）菌株</b><

24、;/p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用菌株均分離自南極沙土樣；DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。</p><p><b>　　（2）試劑</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)中所用主要試劑如下：DNA Marker、Loading Buffer、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體克隆試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖、DNA純化回收試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程有限公

25、司；其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。</p><p><b>　?。?）儀器</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)所用儀器情況如下：DYY-11型電泳儀（北京市六一儀器廠）、DYCZ-24D型垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）、天能3500-凝膠成像系統(tǒng)、5331-梯度PCR儀、L1低溫連接儀、TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)、YXQ-75SII高壓滅菌鍋等。</p>&

26、lt;p>　　2.2.2 研究方案</p><p><b>　　圖2 研究方案</b></p><p>　?。?）土壤樣本的處理</p><p>　　無菌操作稱取土壤樣1g，放于10mL滅菌帶塞試管中，用滅菌冷卻的PBS緩沖液定容；</p><p>　　劇烈振蕩0.5h，靜置5min，上清即為稀釋10-1 的菌液；

27、</p><p>　　另取裝有10mL滅菌PBS緩沖液的帶塞試管2支，分別編號(hào)10-2、10-3；用移液槍吸取1mL 10-1的稀釋液，沿管壁緩緩注入到編號(hào)10-2的試管內(nèi)，振蕩試管使其混合均勻，制成10-2稀釋液；</p><p>　　同法可制成10-3稀釋液。</p><p>　?。?）細(xì)菌的培養(yǎng)、分離及純化</p><p>　　在對(duì)土壤

28、樣本處理結(jié)束后，需要首先對(duì)沙土樣本中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離以及純化，這一過程中我們選擇了寡營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配制方法如下：稱取MgSO4 0.024 g、磷酸氫二鉀0.3 g、丙酮酸鈉0.3 g、蛋白胨D 0.5 g、 淀粉0.5 g、酵母提取物0.5 g、酪氨酸 0.5 g、胰蛋白胨 9.25 g、瓊脂 15 g。將除瓊脂以外的其他成分加熱溶解，再用K2HPO4或KH2PO4 調(diào)節(jié)PH至7.2，加入瓊脂加熱至溶，于121 ℃

29、滅菌15 min，并于無菌室內(nèi)將剛滅完菌，未冷卻的R2A培養(yǎng)基倒入平板待用。在培養(yǎng)基配制完成后，分別按照培養(yǎng)、分離、純化的順序?qū)Υ郎y(cè)樣品中的細(xì)菌進(jìn)行研究。</p><p>　　在細(xì)菌的培養(yǎng)取過程中首先分別取濃度為10-2,10-3土壤稀釋液各100 μL,分別輕輕均勻涂布到R2A平板上。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，于20℃，倒置培養(yǎng)，每天觀察，觀察一周，使寡營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌在最短時(shí)間內(nèi)得到良好的培養(yǎng)環(huán)境。之后于4℃環(huán)境下培養(yǎng)1

30、-2周，從而為南極環(huán)境中嗜寒適冷細(xì)菌提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。</p><p>　　在細(xì)菌培養(yǎng)過程中每天對(duì)平板進(jìn)行觀察，記錄下單菌落的個(gè)數(shù)及生長(zhǎng)時(shí)間。根據(jù)單菌落的形態(tài)，大小，顏色不同，從平行中挑取單菌落在R2A平板上進(jìn)行劃線分離。再將劃線所得的單菌落接種于R2A液體培養(yǎng)基中。從而達(dá)到分離和純化細(xì)菌的目的。</p><p>　?。?）細(xì)菌耐藥性檢測(cè)</p><p><

31、b>　　① 平板涂布</b></p><p>　　在無菌環(huán)境中，用無菌棉簽從培養(yǎng)容器中蘸取稀釋過的菌液，均勻涂于固體培養(yǎng)基表面，每次旋轉(zhuǎn)平板90°，共涂3次，最后沿平板內(nèi)壁邊緣涂一圈，使整個(gè)平板涂布均勻，分別涂布4塊平板。</p><p><b>　　② 藥敏紙片</b></p><p>　　平板放置3到5分鐘，用記

32、號(hào)筆和尺子將平板分成均等的4個(gè)區(qū)域；用無菌鑷子取4種不同抗生素藥敏紙片，分別貼于平板所劃分好的4個(gè)區(qū)域，并輕壓一下紙片，使其貼平。紙片之間相距大約3mm。 一種菌做15種抗生素，4個(gè)平板一組，每組菌各個(gè)平板抗生素藥敏紙片貼的位置相同，以便觀察結(jié)果。</p><p><b>　?、?培養(yǎng)觀察</b></p><p>　　將貼好紙片的培養(yǎng)皿8個(gè)一組，用保鮮膜包好，放在無光

33、照，20℃恒溫箱培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察抑菌圈大小，記錄結(jié)果并且拍照保存。</p><p><b>　?。?）菌落PCR</b></p><p>　　對(duì)已知耐藥表型的細(xì)菌進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，檢測(cè)過程中利用特異性的PCR引物（表2）直接對(duì)細(xì)菌模板進(jìn)行菌液PCR。PCR體系及循環(huán)設(shè)置情況如下：</p><p>　　在0.2 mL EP管中分別加入M

34、ix 25μL、引物F1 1.5μL、引物F2 1.5μL、菌液 2μL、DEPC水 20μL。編號(hào)，倒置輕敲使其充分混合，再微離；將EP管放入PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。94 ℃預(yù)變性5 min；主循環(huán)94 ℃ 30s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)36次；終延伸72 ℃ 10 min;10 ℃ 保存。反應(yīng)結(jié)束后，各取3-5µL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物割膠回收純化的具體步驟依照試劑盒說明書進(jìn)行操

35、作。</p><p>　　表2 PCR擴(kuò)增所用引物信息[17]</p><p><b>　?。?）克隆測(cè)序</b></p><p>　　PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化后，需要進(jìn)行測(cè)序以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。但是目前利用PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果比較差，也此一般需要對(duì)目的基因進(jìn)行重組克隆后進(jìn)行測(cè)序。</p><p>　　T載體與PC

36、R產(chǎn)物的連接：</p><p>　　1）在微量離心管中配置下列DNA溶液，全量為5µL。pMD18-T 0.5µL，純化的PCR產(chǎn)物4.5µL（目的片段與載體的摩爾量之比為1:3-1:10）</p><p>　　2）加入5µL（等量）的SolutionⅠ</p><p><b>　　3）16℃連接過夜</b&g

37、t;</p><p><b>　　轉(zhuǎn)化及克?。?lt;/b></p><p>　　1）100µL的感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍至剛好融化；</p><p>　　2）上述連接產(chǎn)物（全量10µL）加入至100µL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中冰中放置30分鐘；</p><p>　　3）42℃熱激90秒鐘后，立即冰中放

38、置3min。</p><p>　　4）加入890µL預(yù)熱的不含Amp的SOC液體培養(yǎng)基后，37℃搖床培養(yǎng)1-1.5h；</p><p>　　5）4000rpm，室溫離心5min，去上清850，留400µL，剩下吹打均勻；</p><p>　　6）抽取100µL上述混合液均勻涂布到含Amp(100µg/mL)的LB平板上，37℃

39、靜止培養(yǎng)12-14h。</p><p>　　重組質(zhì)粒的提取與鑒定</p><p>　　1）挑取單菌落于含Amp(100µg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6-8h。</p><p>　　2）取培養(yǎng)液1.5 mL，10000rpm，室溫離心4min，棄去上清，倒置于吸水紙上，使培養(yǎng)液流盡；</p><p>　　2）加入100

40、μL冰預(yù)冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，調(diào)pH值至8.0），振蕩混勻，冰浴5min；</p><p>　　3）加入200μL溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1%SDS），溫和顛倒數(shù)次，混勻，冰浴5min；</p><p>　　4）加150μL溶液Ⅲ（5mol/L醋酸鉀60mL，冰醋酸11.5mL，ddH2O 28.5m

41、L），上下顛倒混勻，冰浴5min；</p><p>　　5）12000rpm，4℃離心10 min，將水相轉(zhuǎn)至干凈的1.5mL EP管；</p><p>　　6）加入等體積酚/氯仿，上下顛倒混勻，13000rpm，離心6min；</p><p>　　7）將上清移至另一1.5mL EP管中，加入1/10體積的NaAc(pH值5.2)和2倍體積的無水乙醇（使用前均-20

42、℃預(yù)冷），充分混勻，室溫放置5min后，13000rpm，4℃離心10min；</p><p>　　8）棄上清，沉淀加1mL 70%乙醇漂洗，13000rpm，4℃，離心6min；棄上清，沉淀于室溫或37℃干燥20-30min，加20μL左右的溶有RNA酶（20µg/mL）的ddH2O，溶解DNA，短暫振蕩或用加樣器上下吹打混勻，37℃作用30min備用；</p><p>　　9

43、）取3-5μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。</p><p>　　與空載體比較，選取瓊脂糖電泳速度較慢者進(jìn)行雙酶切鑒定，建立如下反 應(yīng)體系：10×buffer 2μL 、SalⅠ 1μL 、EcoR I 1μL 、重組質(zhì)粒 5μL 、加DEPC水至20μL。37℃水浴3h。取3-5μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳。</p><p>　　10）重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定</p><p>

44、;　　將PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。</p><p><b>　　（6）序列比對(duì)分析</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中主要采用ClustalX和Lasergene軟件包中的MegAlign軟件配合NCBI中的Blast軟件完成多重序列比對(duì)，比對(duì)采用ClustalW的方法進(jìn)行。</p><p><b&

45、gt;　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)、分離與純化</p><p>　　利用R2A培養(yǎng)基對(duì)3個(gè)采樣點(diǎn)的南極沙土中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和分離、純化，共計(jì)挑取純化獲得純培養(yǎng)72株細(xì)菌，其中SOZ1 26株，SOZ2 23株，SOZ3 23株。</p><p><b>　　3.2 耐藥性檢測(cè)</b></p>

46、;<p>　　利用24種抗生素對(duì)純化的72株細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)分離的結(jié)果顯示，在9種抗生素（米若環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素、甲氧嘧啶、左氟沙星、頭孢拉定、萘啶酸、利福平、環(huán)丙沙星）中沒有發(fā)現(xiàn)有耐藥性現(xiàn)象，在其它15種抗生素均發(fā)現(xiàn)有不同的耐藥現(xiàn)象。南極沙土中的細(xì)菌的耐藥性圖譜如下所示（圖3）。</p><p>　　圖3 南極沙土中的細(xì)菌的耐藥性圖譜</p><p>　　3.3 PCR擴(kuò)

47、增結(jié)果</p><p>　　根據(jù)2.2.4中所提供的反應(yīng)體系與循環(huán)設(shè)置方法，結(jié)合圖3中細(xì)菌耐藥性情況分別利用各自耐藥表現(xiàn)型所對(duì)應(yīng)的引物組合對(duì)耐四環(huán)素的13株細(xì)菌和耐氨芐青霉素的41株細(xì)菌進(jìn)行了菌液PCR。由于部分細(xì)菌具有多重耐藥性，對(duì)于這些樣品也同樣進(jìn)行了多種引物的擴(kuò)增。下面將分別針對(duì)耐四環(huán)素細(xì)菌和耐氨芐青霉素細(xì)菌的基因擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行介紹。</p><p>　　3.3.1 耐四環(huán)素基因的PC

48、R擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　通過耐藥性圖譜可以發(fā)現(xiàn)，72株南極沙土中的細(xì)菌中共有13株具有對(duì)四環(huán)素的耐藥性，我們也利用表2中所對(duì)應(yīng)的20對(duì)引物分別進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，部分?jǐn)U增結(jié)果如以下圖片所示。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在利用所有引物對(duì)耐四環(huán)素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程中，共獲得陽性結(jié)果19個(gè)。</p><p>　　圖4 引物tet(Q)和tet(W)在耐四環(huán)素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p>&l

49、t;p>　　其中M為Marker DL2,000；1-5號(hào)點(diǎn)樣孔分別為引物tet（Q）在SOZ2-406、SOZ1-310、SOZ1-618、SOZ1-612和SOZ1-717號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物；6-10號(hào)點(diǎn)樣孔為引物tet（W）在SOZ2-406、SOZ1-310、SOZ1-618、SOZ1-612和SOZ1-717號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p>　　圖5 引物tet(M)和tet(Q)在耐四

50、環(huán)素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-13號(hào)點(diǎn)樣孔分別為引物tet（M）在SOZ2-202、SOZ2-411、SOZ2-413、SOZ3-508、SOZ3-605、SOZ1-607、SOZ1-608、SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-717、SOZ1-718號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物；14號(hào)點(diǎn)樣孔為引物tet（Q）在SOZ1-310號(hào)細(xì)菌樣品

51、中的擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p>　　圖6 tet(A)等4種引物在耐四環(huán)素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-24號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物tet(A)、tet(B)、tet(E)及tet（H）在SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-703、SOZ1-717、SOZ1-718號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p

52、>　　圖7 引物tet(J)與tet(Z)在耐四環(huán)素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-12號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物tet(A)、tet(B)、tet(E)及tet（H）在SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-703、SOZ1-717、SOZ1-718號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物</p><p>　　3.3.2 耐氨芐青霉素基

53、因的PCR擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　利用耐氨芐青霉素細(xì)菌檢測(cè)所對(duì)應(yīng)的引物4種引物對(duì)耐氨芐青霉素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在引物SHV和CARB中共獲得了22個(gè)陽性克隆結(jié)果（見圖8-圖11）。</p><p>　　圖8 引物SHV在耐氨芐青霉素細(xì)菌中的PCR擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-24號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物SHV在SOZ2

54、-203、SOZ2-207、SOZ2-208、SOZ2-210、SOZ3-211、SOZ3-502、SOZ1-301、SOZ1-309、SOZ1-312、SOZ1-313、SOZ1-314、SOZ1-316、SOZ2-3172、SOZ2-402、SOZ2-406、SOZ2-407、SOZ2-408、SOZ2-410、SOZ2-411、SOZ2-413、SOZ3-505、SOZ2-506、SOZ1-507及SOZ3-510號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)

55、增產(chǎn)物</p><p>　　圖9 引物SHV在耐氨芐青霉素細(xì)菌中的PCR擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-17號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物SHV在SOZ3-512、SOZ3-516、SOZ2-518、SOZ3-520、SOZ2-601、SOZ3-602、SOZ1-603、SOZ1-604、SOZ1-607、SOZ1-609、SOZ1-610、SOZ3-701、S

56、OZ1-703、SOZ1-704、SOZ1-706、SOZ1-709及SOZ1-717號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物；18號(hào)點(diǎn)樣孔為陰性對(duì)照</p><p>　　圖10 引物CARB在耐氨芐青霉素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000; 1-12號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物CARB在SOZ2-203、SOZ2-207、SOZ2-208、SOZ2-210、SOZ3-211、

57、SOZ3-502、SOZ1-301、SOZ1-309、SOZ1-312、SOZ1-313、SOZ1-314及SOZ1-316號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　圖11 引物CARB在耐氨芐青霉素細(xì)菌中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000; 1-12號(hào)點(diǎn)樣孔分別是引物CARB在SOZ2-317、SOZ2-411、SOZ3-505、SOZ2-506、SO

58、Z1-507、SOZ3-510、SOZ3-512、SOZ3-516、SOZ2-518、SOZ3-520及SOZ1-706號(hào)細(xì)菌樣品中的擴(kuò)增結(jié)果</p><p>　　3.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定</p><p>　　重組質(zhì)粒的提取結(jié)果以及雙酶切鑒定結(jié)果如圖9和10所示。由圖中所示電泳情況可以得知，重組克隆為攜帶有目的片段的陽性克隆，可以進(jìn)行測(cè)序。</p><p>　　圖

59、9 質(zhì)粒電泳示意圖</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-6為6個(gè)質(zhì)粒樣品</p><p>　　圖10 雙酶切鑒定結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-6為相應(yīng)的質(zhì)粒酶切結(jié)果</p><p>　　3.3.4 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果</p><p>　　通過上述幾種檢測(cè)的初步結(jié)

60、果，對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒酶切驗(yàn)證所獲得的陽性樣品進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，從而確定各耐藥性細(xì)菌的耐藥基因型。具體測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果如下：</p><p>　?。?）耐四環(huán)素細(xì)菌的基因型</p><p>　　通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)共在耐四環(huán)素細(xì)菌中獲得19個(gè)陽性結(jié)果，其中也包含同一細(xì)菌樣品同時(shí)檢測(cè)出兩種基因型的結(jié)果，如SOZ1-7172號(hào)樣品同時(shí)檢測(cè)出tet(Q)和tet(W)

61、的耐藥基因型。通過測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)其中部分假陽性結(jié)果進(jìn)行了排除并最終確定了耐四環(huán)素細(xì)菌的耐藥基因型（表3）。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，通過PCR克隆測(cè)序的方法檢測(cè)確定了耐四環(huán)素南極沙土樣中可培養(yǎng)細(xì)菌9株細(xì)菌的耐藥基因型，其中tet（Q）型2株，tet（W）型1株，tet（B）型6株，各基因型的檢出率如圖11所示。</p><p>　　表3 耐四環(huán)素細(xì)菌的耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　其中

62、“＋”為陽性，“-”為陰性</p><p>　　圖11 耐四環(huán)素細(xì)菌基因型的檢出率</p><p>　　（2）耐氨芐青霉素細(xì)菌的基因型</p><p>　　與耐四環(huán)素細(xì)菌的檢測(cè)相似，通過對(duì)耐氨芐青霉素細(xì)菌進(jìn)行的PCR檢測(cè)共獲得22個(gè)陽性結(jié)果，對(duì)這些陽性結(jié)果加以測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其中CARB引物的4個(gè)檢出結(jié)果全部為假陽性從而確定了其余18個(gè)樣品屬于SHV型耐氨芐青霉素細(xì)菌。

63、具體菌株信息如表4所示，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，在諸多具有耐氨芐青霉素表現(xiàn)型的南極沙土中的細(xì)菌中只檢測(cè)到了18株SHV型細(xì)菌，檢出率為81.82%，雖然通過PCR擴(kuò)增得到了4株CARB型細(xì)菌，但是通過測(cè)序分析證實(shí)這4株實(shí)際上并非真正的CARB型細(xì)菌，同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)有TEM型細(xì)菌存在。兩種耐氨芐青霉素細(xì)菌基因型的檢出率如圖12所示。</p><p>　　表4 耐氨芐青霉素細(xì)菌的耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果</p>

64、<p>　　其中“＋”為陽性，“-”為陰性</p><p><b>　　4 分析與討論</b></p><p>　　4.1 三個(gè)站點(diǎn)細(xì)菌耐藥性的比較</p><p>　　本文通過對(duì)南極中山站三個(gè)采樣點(diǎn)的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)、耐藥性及耐藥基因型的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)南極站點(diǎn)細(xì)菌間的部分特征存在一定的差異。首先，本文利用R2A培養(yǎng)基對(duì)三個(gè)站點(diǎn)樣品進(jìn)行

65、培養(yǎng)的結(jié)果顯示SOZ1的細(xì)菌數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于SOZ2和SOZ3。而從耐藥性的角度講，雖然三個(gè)站點(diǎn)在耐藥性種類上并無明顯差別，但是在耐藥細(xì)菌的數(shù)量和多重耐藥性上有一定的差異。從耐藥性圖譜中也可以看出，SOZ1的細(xì)菌耐藥性總數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他兩個(gè)站點(diǎn)的細(xì)菌樣品，在細(xì)菌樣品數(shù)量基本一致的前提下，這說明與其他站點(diǎn)相比SOZ1細(xì)菌樣品中具有耐藥性的細(xì)菌比例和細(xì)菌多重耐藥性比例更高。以青霉素耐藥性為例，SOZ3的青霉素耐受比例僅為9%，而SOZ1和SO

66、Z2則均高于30%（圖13）。</p><p>　　由于環(huán)境中抗生素的濃度增加，細(xì)菌的選擇壓力也不斷增大，從而導(dǎo)致了抗生素耐藥性細(xì)菌和耐藥基因的出現(xiàn)和傳播，這也是抗生素抗性基因污染的理論基礎(chǔ)之一[18]。除了誘導(dǎo)產(chǎn)生抗生素抗性基因外，自然界本身存在的抗性基因也可能隨著基因轉(zhuǎn)移單位在細(xì)菌中傳播并自我復(fù)制而保留下來。</p><p>　　因此我們推測(cè)，可能造成三個(gè)站點(diǎn)細(xì)菌差異的原因有兩個(gè)。其一

67、是通過傳播渠道，譬如各種飛禽和水生動(dòng)物等，隨著人類使用抗生素?cái)?shù)量的增加，這些動(dòng)物接觸抗生素的機(jī)會(huì)也大大增加，他們所攜帶的細(xì)菌耐藥性也不斷增強(qiáng)，在向南極遷徙運(yùn)動(dòng)過程中，細(xì)菌中的耐藥基因也得到了傳播[19]。自然對(duì)于更加靠近其他南半球大陸而遠(yuǎn)離南極點(diǎn)的站點(diǎn)而言，這種機(jī)會(huì)也更大。此外，我們認(rèn)為出現(xiàn)三個(gè)站點(diǎn)細(xì)菌耐藥性差異的一個(gè)重要原因便是人類活動(dòng)的影響[20]。從表1也可以看出，人類活動(dòng)對(duì)于三個(gè)站點(diǎn)的影響程度也不盡相同。SOZ1位于與人類生產(chǎn)生

68、活具有密切聯(lián)系的排污口處，SOZ2位于站區(qū)內(nèi)的直升機(jī)停機(jī)坪旁，而SOZ3則位于人跡罕至的石縫中，相比之下人類活動(dòng)對(duì)于三個(gè)采樣點(diǎn)的影響由SOZ1至SOZ3遞減。在人類醫(yī)療等活動(dòng)中，抗生素的使用對(duì)南極環(huán)境造成了污染，并誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗生素污染。</p><p>　　4.2 β-內(nèi)酰胺類耐藥細(xì)菌基因分析</p><p>　　β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，主要包括青霉素類和頭孢類兩

69、大類。青霉素通過與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成從而達(dá)到殺菌的目的。隨著該類抗生素的使用，也出現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類耐藥性細(xì)菌，細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性主要是通過編碼β-內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)的，它可以將青霉素等抗生素水解從而達(dá)到抗藥的效果[21]。本文也圍繞南極沙土中的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性進(jìn)行了分析，結(jié)果在三個(gè)站點(diǎn)中均發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性細(xì)菌的存在[22]。但是通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)站點(diǎn)對(duì)氨芐青霉素的耐受比例也存在

70、差異。其中SOZ3中也有多株細(xì)菌具有β-內(nèi)酰胺類耐藥性，這說明在沒有外界抗生素壓力的環(huán)境中也依然存在β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因[23]。而SOZ1和SOZ2對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受比例要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SOZ3，這也再次證實(shí)了人類活動(dòng)對(duì)細(xì)菌耐受性出現(xiàn)的影響。</p><p>　　根據(jù)耐藥性機(jī)制和耐藥基因型的不同，β-內(nèi)酰胺類耐藥細(xì)菌又分為TEM型、SHV型等。其中TEM型和SHV型均屬于質(zhì)粒介導(dǎo)的，TEM類和SHV類E

71、SBLs也最為常見。TEM類是由TEM-1、TEM-2活性部位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換衍生而來，而SHV類，是由SHV-1進(jìn)化而來，同TEM相似度較高[24]。本文通過一對(duì)特異性引物對(duì)耐青霉素細(xì)菌的基因型進(jìn)行檢測(cè)，并只檢測(cè)得到了SHV型的耐藥性細(xì)菌。這說明南極沙土中的細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素的耐藥性是通過所攜帶的含SHV基因的質(zhì)粒編碼特定的β-內(nèi)酰胺酶達(dá)到的。</p><p>　　近年來，隨著β-內(nèi)酰胺類耐藥性細(xì)菌的增加，

72、也在部分細(xì)菌中出現(xiàn)了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）的問題，針對(duì)該問題也出現(xiàn)了第三代頭孢菌素和氨曲南等藥品[25]。頭孢哌酮便是第三代頭孢菌素的一種，但是通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)目前在南極沙土中的細(xì)菌樣品中只有極為少數(shù)的耐該類藥物的細(xì)菌存在。且這些細(xì)菌只存在于SOZ1和SOZ2中，目前尚未在SOZ3中發(fā)現(xiàn)。這也可能是人類活動(dòng)尚未影響該地的一種表現(xiàn)。</p>&l

73、t;p>　　圖13 三個(gè)站點(diǎn)氨芐青霉素耐受比例分析</p><p>　　4.3 耐四環(huán)素類細(xì)菌基因型分析</p><p>　　四環(huán)素類抗生素是在結(jié)構(gòu)上具有并四苯環(huán)骨架的一類抗生素藥物，自從上世紀(jì)40年代被發(fā)現(xiàn)以來，四環(huán)素便作為一種常用的廣譜類抗生素使用[26]。四環(huán)素類抗生素可以阻止氨酰-tRNA與核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合從而阻止細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抗生素。隨著四環(huán)素類抗生素不合理應(yīng)用現(xiàn)象的增

74、加，導(dǎo)致耐藥菌及耐藥現(xiàn)象不斷的變異和增加[27]。從細(xì)菌耐藥機(jī)制的角度講，細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥機(jī)制主要包括主動(dòng)外輸?shù)鞍住⒑颂求w保護(hù)蛋白、四環(huán)素滅活或鈍化酶及16S rRNA基因突變影響與四環(huán)素結(jié)合四種[28]。根據(jù)上述機(jī)制的不同，耐四環(huán)素類細(xì)菌基因型也不盡相同，例如常見的tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、tet(G)等類型屬于外排蛋白類，具有這種基因型的細(xì)菌可以編碼產(chǎn)生單一特異性的外排蛋白，并將

75、四環(huán)素與金屬離子的復(fù)合物通過外排的方式排出細(xì)菌體外，實(shí)現(xiàn)耐藥性。而tet(M)、tet(O)、tet(B)/P、OTR等類型則通過編碼核糖體保護(hù)蛋白，促使已結(jié)合的四環(huán)素移位及縮短游離四環(huán)素半衰期的方式實(shí)現(xiàn)其耐藥性[29]。</p><p>　　利用克隆測(cè)序的方法對(duì)耐四環(huán)素細(xì)菌的基因進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南極沙土中的細(xì)菌中存在3種不同的四環(huán)素耐藥基因型，且這三類基因型的站點(diǎn)分布具有一定的特點(diǎn)（圖14）。從基因型與站點(diǎn)

76、的分布可以看出，tet(B)型細(xì)菌在耐四環(huán)素細(xì)菌中所占的比例最高，這說明南極沙土中的細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性大多是通過主動(dòng)外輸?shù)鞍椎姆绞綄?shí)現(xiàn)的。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)tet(W)型和tet(Q)型分別只在站點(diǎn)2和站點(diǎn)1中存在。Tet(W)型與tet(Q)型均是利用核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制達(dá)到耐藥性，但是兩個(gè)站點(diǎn)基因型的不同且并不在其它站點(diǎn)出現(xiàn)說明具有該種基因型的細(xì)菌尚未傳播至另外的站點(diǎn)。</p><p>　　圖14 耐四環(huán)素細(xì)菌

77、的基因型與站點(diǎn)分布情況</p><p>　　4.4 南極沙土中的細(xì)菌與其他陸源細(xì)菌耐藥基因型的比較</p><p>　　養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中的抗性菌株是環(huán)境中抗生素抗性基因的主要來源。微生物通過質(zhì)粒等媒介交換水平轉(zhuǎn)移基因從而傳播抗性基因[30]。環(huán)境中的抗生素水平基本沒有環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，目前已有16種四環(huán)素類抗性基因，10種β-內(nèi)酰胺類抗性基因在廢水、河流、污水處理廠、土壤、空氣等環(huán)境介質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)[3

78、1]。曾研究發(fā)現(xiàn)，人為活動(dòng)干擾的環(huán)境介質(zhì)中抗性基因濃度明顯高于未受到人類干擾地區(qū)[32]。</p><p>　　與其他普通陸源細(xì)菌相比，南極沙土中的細(xì)菌具有自身獨(dú)特的環(huán)境特點(diǎn)，它們的生存環(huán)境與普通陸源細(xì)菌相比更為復(fù)雜和殘酷，同時(shí)相對(duì)來說受到人類活動(dòng)的影響也小一些，與其它陸源細(xì)菌間的基因交流也相對(duì)較少[33]。這種環(huán)境條件也造成了南極沙土中的細(xì)菌與普通陸源細(xì)菌相比在耐藥性方面呈現(xiàn)出一定的特點(diǎn)。</p>

79、<p>　　首先，在對(duì)常用的普通抗生素，如四環(huán)素、氨芐青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性方面，南極沙土中的細(xì)菌的耐藥性受人類活動(dòng)的影響顯著。在人類活動(dòng)較為頻繁的區(qū)域，其細(xì)菌的耐藥性與普通陸源細(xì)菌極為相似，但是對(duì)于人之罕至的地區(qū)而言，這種耐藥性也要更低一些[34]。</p><p>　　此外，對(duì)于新型抗生素類藥物，如第三代頭孢菌素等的耐藥性方面，南極沙土中的細(xì)菌的耐藥性要顯著低于其他陸源細(xì)菌[35]。這

80、是因?yàn)閷?duì)其他陸源細(xì)菌所面臨的抗生素選擇壓力大，誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥基因也相對(duì)較多。這種陸源耐藥基因的產(chǎn)生與醫(yī)療環(huán)境中的抗生素的大量使用有著直接的聯(lián)系[36]。通過本研究也可以看出，我們只在頭孢哌酮中發(fā)現(xiàn)了5株耐藥細(xì)菌，且在SOZ3中并未發(fā)現(xiàn)該抗生素的耐藥細(xì)菌。這說明與其他陸源細(xì)菌相比，南極沙土中的細(xì)菌的耐藥性顯得更為滯后，其耐藥基因的進(jìn)化也更慢。</p><p><b>　　5 結(jié)論</b><

81、;/p><p>　　本文通過對(duì)南極沙土中的細(xì)菌的分離、純化以及其耐藥性的表現(xiàn)型和基因型研究，主要獲得了以下結(jié)論：</p><p>　?。?）人類活動(dòng)對(duì)南極環(huán)境造成了一定的影響并誘導(dǎo)了細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，同時(shí)本研究也再次證實(shí)在沒有外界抗生素壓力的原始環(huán)境中耐藥現(xiàn)象和多重耐藥仍然存在。</p><p>　　（2）南極極端環(huán)境中存活的細(xì)菌具有多種耐藥性，并且多株細(xì)菌存在多重耐藥

82、性等現(xiàn)象。</p><p>　?。?）即使對(duì)于具有同種耐藥表現(xiàn)型的細(xì)菌，其耐藥基因型也不盡相同，對(duì)闡述其耐藥機(jī)制提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。</p><p>　　隨著各種極地活動(dòng)的增加，南極原始的生態(tài)環(huán)境也面臨著越來越多的威脅，雖然近年來國(guó)內(nèi)外研究人員也針對(duì)極地環(huán)境、極地微生物的多樣性和極地微生物的耐藥性進(jìn)行了諸多相關(guān)研究，但是現(xiàn)狀仍不容樂觀[37]。本論文從細(xì)菌耐藥性的角度出發(fā)考察了人類科考活動(dòng)對(duì)

83、南極中山站周邊土壤環(huán)境微生態(tài)的影響，為進(jìn)一步的研究和南極生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供了基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 龐小平, 王自磐, 鄂棟臣. 南極生態(tài)環(huán)境分類及其脆弱性分析[J].測(cè)繪與空間地理信息, 2006, 29(6): 1-8.</p><p>　　[2] Carpenter, E. J.,

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