食品中大腸菌群的測定

1、食品中大腸菌群測定（一）,參考 GB4789．3-2010,1、  了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中的意義。   2、練習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗(yàn)方法 。,一、目的,二、原理,1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37℃、24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。,主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的Ⅲ亞屬細(xì)菌組成。

2、,該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群近似可能數(shù)MPN（the most probable number-簡稱MPN）表示,2、測定的意義,3、大腸桿菌的生物學(xué)特性,基本形態(tài) 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0

3、.8μm*1.0-3.0 μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。,在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在

4、生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。,,培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44 ℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 ℃。,三 、材料,1、食品樣品乳制品,除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計(jì)數(shù)器等。,3、

5、 儀器設(shè)備,月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯、 煌綠乳糖膽鹽（BGLB ）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) 、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH ) 、 1mol/L 鹽酸（HCI ) 。,4、 培養(yǎng)基和試劑,第一法 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法。第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法。,四、 檢驗(yàn)方法,10倍系列稀釋,選擇合適稀釋度接種LST 肉湯管 36℃±1℃.48h

6、77;2h,產(chǎn)氣,不產(chǎn)氣,25 g 檢樣-225 mL 稀釋液,大腸菌群陰性,BGLB肉湯(36±1)℃48h±2h,不產(chǎn)氣,大腸菌群陽性,大腸菌群陰性,產(chǎn)氣,報告,,,,,,,,,,,,,大腸菌群MPN檢驗(yàn)流程,,,,,,查MPN表,,,,1、樣品的稀釋（1） 固體和半固體樣品稱取25g 樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min-10000r/min 均質(zhì)1 min-

7、2 min ，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的樣品勻液。,第一法 大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法,（2） 液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的樣品勻液。 （3） 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.5-7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaO

8、H ）或1 mol/L 鹽酸（HCI ）調(diào)節(jié)。,,,（4） 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。,（5）根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品

9、勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。,每個樣品，選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）, 36℃±1℃ 培養(yǎng)24h±2h ，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h 。,2、 初發(fā)酵試驗(yàn),記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。未產(chǎn)

10、氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。,用接種環(huán)從所有48h±2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，36℃±1℃ 培養(yǎng)48h±2h ，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。,3、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn),根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN 表（見附錄B ) ，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值。注意：當(dāng)檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也

11、應(yīng)相應(yīng)減少或增加。,4、 大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報告,第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)法,,大腸桿菌0157顯色培養(yǎng)基上的菌落,在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上,大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征,典型菌落為紅色 , 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 2-3mm 或更大。,大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征,典型菌落為紫紅色 , 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 0.5mm 或更大。,大腸桿菌在MFC瓊脂上的典

12、型特征,試驗(yàn)流程,1、 樣品的稀釋,按第一法中的稀釋方法進(jìn)行。,（1） 選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2） 及時將15 mL-20mL冷至46℃ 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃ 培養(yǎng)1

13、8h-24h 。,2、 平板計(jì)數(shù),（3） 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150 之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。,2、 平板計(jì)數(shù),（4）、 證實(shí)試驗(yàn) 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，36℃±1℃ 培養(yǎng)24h-48h ，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可

14、報告為大腸菌群陽性。,2、 平板計(jì)數(shù),（5）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報告 經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。,2、 平板計(jì)數(shù),,例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取 其中10個接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0

15、5;105 CFU/g（mL）。,國標(biāo)4789.3的08版與03版主要不同,1、名稱更改 以大腸菌群計(jì)數(shù)代替原來的大腸菌群測定。2、增加了大腸菌群的平板計(jì)數(shù)法和紙片檢測法。3、大腸菌群的MPN法以乳糖為主改為以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯為主的要培養(yǎng)基的MPN法。4、大腸菌群的MPN法中原“報告每100 ml （或g）大腸菌群的MPN值”改為“報告每1 ml （或1g）大腸菌群的MPN值”。,,比較區(qū)別GB/T4

16、789.38 -- 2008大腸桿菌的計(jì)數(shù),03版  流程,一、  步驟,取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法相同，做成1:10的均勻稀釋液為檢樣。,同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照 。,1、乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計(jì)，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。,接種量在1ml以上者，用雙料

17、乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種混合接種于1支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵管對照。,置36±1℃溫箱培養(yǎng)24±2小時，如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則與對照的混合菌種一起按下列程序進(jìn)行。,2 、分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24

18、小時后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。,可疑菌落特點(diǎn)：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。,3 、證實(shí)試驗(yàn) 在上述平板上挑取可疑大腸菌落1～2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱培養(yǎng)24±2小時,觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。,4 、報告 根

19、據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。,二、結(jié)果    根據(jù)證實(shí)大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表(見附錄)報告每100ml(克)大腸菌群的最可能數(shù)。,三、注意事項(xiàng),1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗(yàn)，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相當(dāng)多的合格樣品作為不合格處理，應(yīng)注意。,2、膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌

20、的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。,3、接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。,4、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應(yīng)取典型菌落，如無應(yīng)多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。 一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且革蘭氏染色為陰性，可做出判定。,5、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡沿管壁上升，應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)生，做

21、進(jìn)一步試驗(yàn)。,6、 MPN檢索表是采用三個稀釋度九管法，較理想的結(jié)果是最低3管為陽性，最高3管為陰性。如無法估測樣品中的菌數(shù)時，應(yīng)做一定范圍的稀釋度。,7、 MPN檢索表只提供了3個稀釋度，若改用其它濃度時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加或減少。,醬油（GB/T2717-2003）細(xì)菌菌落總數(shù)： ≤30000cfu/ml大腸菌群： ≤30MPN/100ml腸道致病菌： 不得檢出,全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999

22、） 特級 一級 二級細(xì)菌菌落總數(shù)：≤20000 ≤30000 ≤50000（cfu/ml）大腸菌群 ≤40 ≤90 ≤90（MPN/100g）腸道致病菌： 不得檢出 不得檢出 不得檢出,巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999）細(xì)菌菌落總數(shù)： ≤300

23、00cfu/ml大腸菌群： ≤90MPN/100ml腸道致病菌： 不得檢出,生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2006）菌落總數(shù)cfu/ml： ≤100總大腸菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得檢出耐熱大腸菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得檢出大腸埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml ：不得檢出,,瓶(桶)裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 17324-2003) 細(xì)