甾體激素 ppt課件

1、第十五章 甾體激素類藥物的分析,4,6,16,基本結(jié)構(gòu),,性 激 素,,腎上腺皮質(zhì)激素,,雄性激素,孕激素,雌激素,分 類,蛋白同化激素,腎上腺皮質(zhì)激素,,,△4–3–酮基,C17–醇酮基,,氫化可的松,腎上腺皮質(zhì)激素,,,,,醋酸地塞米松,腎上腺皮質(zhì)激素,,,曲安奈德,腎上腺皮質(zhì)激素,,地塞米松磷酸鈉,,雄性激素,,,雄性激素,,,,丙酸睪酮,蛋白同化激素,,,,,苯丙酸諾龍,孕激素,,,C17-甲酮基,孕激素,,醋酸甲地孕酮,

2、雌性激素,,,雌性激素,,,此外,,一、基本結(jié)構(gòu)與分類,1. 腎上腺皮質(zhì)激素,2.雄性激素及蛋白同化激素,3. 孕激素,4. 雌性激素,二、理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn),比旋度：不對(duì)稱物質(zhì)具有旋光性，當(dāng)偏振光透過1 dm，樣品濃度為1 g/ml的溶液，在一定波長和溫度下測(cè)得的旋光度稱為比旋度。,,,,（一）理化性質(zhì),吸收系數(shù)：在給定的波長、溶劑和溫度等條件下，吸光物質(zhì)在單位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸光度。反映了藥物的紫外吸收特征,（一）理化性質(zhì)

3、,（二）鑒別試驗(yàn),薄層色譜法,制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn),高效液相色譜法,紫外分光光度法,紅外分光光度法,化學(xué)鑒別法,,,,鑒別試驗(yàn),,,,,（一）化學(xué)鑒別法,1.與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng),甾體激素類藥物,呈色,,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,母核的一般鑒別試驗(yàn),與硫酸顯色反應(yīng),2.官能團(tuán)的反應(yīng),腎上腺皮質(zhì)激素藥物,呈色,,四氮唑鹽OHˉ,（1） C17 – α– 醇酮基,還原性,呈色反應(yīng),此外還有斐林試液、多倫試

4、液,四氮唑比色法,甾酮類激素藥物,腙（黃色）,羰基試劑,（2） C3–酮基和C20–酮基,常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼,,具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物,藍(lán)紫色,,亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛,（3）甲酮基,黃體酮,藍(lán)紫色,,亞硝基鐵 氰化鈉,其他甾體,,,淡橙色或不顯色,雌激素類藥物,紅色偶氮染料,,重氮苯磺酸,（4） 酚羥基,含炔基的甾體激素,銀鹽沉淀,,硝酸銀,（5） 炔烴的沉淀

5、反應(yīng),,↓,有機(jī)氟,Fˉ,,有機(jī)破壞,有機(jī)氯,,,Clˉ,（6） 有機(jī)鹵素,,茜素氟藍(lán) 硝酸亞鈰,硝酸—硝酸銀,,AgCl↓,呈藍(lán)紫色,一般先進(jìn)行水解，生成相應(yīng)的羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)來進(jìn)行鑒別。,（7） 酯的反應(yīng),△４-3-酮、苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu),（二） UV 法,1. 結(jié)構(gòu)依據(jù),240nm左右,280nm左右,2. 示例,曲安息龍,丙酸倍氯米松,溶劑,甲醇,乙醇,20μg/ml,濃度,20μg/ml,結(jié)果判斷,在238nm處有最大

6、吸收,在239nm處有最大吸收，A為 0.57～0.60，在239nm與263nm 處的吸收度比值為2.25～2.45,結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17 –OH C17 –乙炔基,炔雌醇,（三） IR法

7、,1505cm-1,ν,3505cm-1,3300cm-1,ν,1590cm-1,3610cm-1,,酚羥基,醇羥基,1615cm-1,苯環(huán)的骨架振動(dòng),ν,結(jié)構(gòu)特征：△４-3-酮、C17-甲酮基,1700cm-1,?C=O,20位酮基,1665cm-1,3位酮基,1615cm-1,870cm-1,?C-H,雙鍵,（四） TLC法,主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別,方法：對(duì)照品法 要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的

8、主斑點(diǎn)相同。,（五） HPLC法,主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）,方法：對(duì)照品法 要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。,硒的檢查,有關(guān)物質(zhì)的檢查,殘留溶劑的檢查,游離磷酸鹽的檢查,三、 特殊雜質(zhì)檢查,（一）有關(guān)物質(zhì)的檢查,檢查意義：其他甾體與甾體激素藥物結(jié) 構(gòu)相似，也有一定的藥理作 用而又互不相同.,檢查方法（具有

9、一定分離能力） TLC法（高低濃度對(duì)比法） HPLC法（類似高低濃度對(duì)比法）,（1）TLC法（高低濃度對(duì)比法）,判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色,例：炔孕酮中有關(guān)物質(zhì)的檢查供試液：本品+氯仿-甲醇(3:1) 濃度：10mg/ml對(duì)照液：供試液（10mg/ml）+氯仿-甲醇(3:1) 濃度：50μg/ml 層析：供試液 點(diǎn)樣、展開、斑點(diǎn)檢出。 對(duì)照液

10、判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，其熒光強(qiáng)度與對(duì)照溶 液主斑點(diǎn)比較，不得更深。,（2）HPLC法（主成分自身對(duì)照法）,判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積,,藥物,二氨基萘比色法測(cè)定,氧瓶燃燒,(二）硒的檢查,有毒,來源 合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫,（三）有機(jī)溶劑殘留量的檢查,甲醇 ≤ 0.3％,丙酮 ≤5.0% 內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子,以地塞米松磷酸鈉為例 GC法,對(duì)照液：同法 要求：供

11、試品溶液吸光度不得大于對(duì)照溶液吸光度,（四）游離磷酸鹽的檢查,（對(duì)照液 0.0035%KH2PO4）,,,,,,,比色法,紫外分光光度法,,,含量測(cè)定,,,,高效液相色譜法,四、含量測(cè)定,USP、BP、JP均采用,RP－HPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）,（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對(duì)利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾）,測(cè)定對(duì)象：甾體激素類藥物的原料和制劑,示例：地塞米松磷酸鈉的含量測(cè)定色譜條件：固定相 ODS，流動(dòng)相 三乙

12、胺溶液-甲醇-乙腈（55:40:5）檢測(cè)波長242nm系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：n>7000，地塞米松磷酸鈉峰和地塞米松峰分離度應(yīng)大于4.4,,離子對(duì)液相色譜,流動(dòng)相,真空脫氣機(jī),四元泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,紫外檢測(cè)器,熒光檢測(cè)器,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,液質(zhì)聯(lián)用儀,質(zhì)譜檢測(cè)器,流動(dòng)相：對(duì)于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑比例通常不低于5％,四元泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠,檢

13、測(cè)器,,（二）UV法,△４-3-酮 240nm（±）,腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,苯環(huán) 280nm（±）,雌激素,（三）比色法,腎上腺皮質(zhì)激素類,C17-α－醇酮基,強(qiáng)還原性,（1）原理,1. 四氮唑比色法,,三苯甲瓚↓深紅,,[H],,藍(lán)四氮唑（BT）525 nm,（2）方法,對(duì)照品法,（3）討論,A. 基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響,C11= O＞ C11－OH,C21－OH＞

14、C21-酯,B. 溶劑、水分的影響,以無醛乙醇為溶劑，水含量大時(shí)，呈色減慢，不超過5％對(duì)結(jié)果沒有影響,C. O2與光線的影響,避光,隔絕空氣、快速、充N2,D. 堿的種類及加入順序,以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳,加入順序：,皮質(zhì)激素,,堿試液,四氮唑鹽,E. 溫度與時(shí)間,室溫（25℃）反應(yīng)40～45 min,腎上腺皮質(zhì)激素、 雄性激素和蛋白同化激素、孕激素,C3－酮基,（1） 原理,異煙腙（黃）,酮基,異煙肼,-,3,C,HCl,

15、（縮合）,420 nm,,異煙腙（黃色）,（2）方法,對(duì)照品法,（3）討論,反應(yīng)速度（反應(yīng)專屬性）,A.,C3=O＞C17= O 、C20= O C11= O 不反應(yīng),反應(yīng)專屬性 C3－酮基,B. 溶劑的選擇,異煙肼鹽酸鹽→受溶解度的影響,無水甲醇無水乙醇,,,對(duì)試劑的穩(wěn)定性好、呈色強(qiáng)度較無水乙醇中高、但對(duì)植物油的溶解度小,C.水分、溫度、O2與光線的影響,含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓,O2與光線對(duì)反應(yīng)的影響不大,

16、t℃ ↑ → ν↑,,,酸:異煙肼 = 2:1,,,,最大吸收度,鹽酸濃度0.0074mol/L異煙肼濃度0.00365mol/L,D. 酸的種類和濃度及異煙肼的濃度,(1) 原理,H2SO4-乙醇,加熱,H2Oλmax=465,加熱,雌激素,黃色,桃紅,λmax=515,,雌二醇-3-甲醚,,λmax=465nm,λmax=515nm,,,,[(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚],第五節(jié)

17、 體內(nèi)甾體激素類藥物分析,,,,,3,,違禁藥物監(jiān)測(cè),,,方法的專屬性強(qiáng),此類分析的特點(diǎn)：,競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)違禁甾體激素藥物的分析,,[3] Saito K, Yagi K, Ishizaki A, Kataoka H. Determination of anabolic steroids in human urine by automated in-tube solid-phase microextraction coupled wit

18、h liquid chromatography–mass spectrometry. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 52: 727–733[4] Konieczna L, Plenis A, Oledzka I, Kowalski P, B?Aczek T. Optimization of LC method for the determination of t

19、estosterone and pitestosterone in urine samples in view of iomedical studies and anti-doping esearch studies. Talanta, 2011, 83: 804-814,,,,,,,,,,,加內(nèi)標(biāo)物，調(diào)節(jié)PH，加酶進(jìn)行水解一段時(shí)間，離心，取上清液。,用上述制的的樣品，進(jìn)行SPME處理，分離純化后經(jīng)LC-MS分析,示例1：尿中違禁同化激

20、素的SPME/LC–MS檢查,圖：志愿受試者尿樣中睪酮等七種違禁甾體激素藥物的LC-MS測(cè)定,左炔諾孕酮血漿藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究,左炔諾孕酮是一種高效的孕激素，作為速效避孕藥，廣泛應(yīng)用于臨床和計(jì)劃生育。有文獻(xiàn)報(bào)道，建立LC-MS/MS法檢測(cè)血漿中左炔諾孕酮的方法，研究左炔諾孕酮分散片在健康自愿受試者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和相對(duì)生物利用度，并評(píng)價(jià)生物等效性，為臨床用藥提供依據(jù)[5, 6]。,,5. Li-Zi Zh, Guo-Ping Zh,

21、 Hui-Chang B, Liang D, Ying D, Su G, Xiao Ch, Zhi-ying H, Min H.  Determination of levonorgestrel in human plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry method: application to a bioequivalence study of tw

22、o formulations in healthy volunteers. Biomed Chromatogr, 2008, 22: 519–5266. 李健和，徐平聲，戴智勇，等. 左炔諾孕酮分散片在健康人體中藥動(dòng)學(xué)和生物等效性.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009, 28(8): 644-648,示例2：左炔諾孕酮分散片的人體藥動(dòng)學(xué)研究,對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)考查,,,,,,,,,,,,,,,,,穩(wěn)定性,專屬性,線性與范圍,提取回收率,準(zhǔn)