第三篇基因信息的傳遞

1、,DNA的生物合成(復制)DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,,Central Dogma,描述遺傳信息流動的方向,1958年 F.crick,,逆轉(zhuǎn)錄酶,1970年 對中心法則進行了補充,復制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。,第一節(jié),復制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication,一、半保留復制的實驗依據(jù)

2、和意義,子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式,全保留式 半保留式 混合式,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,密度梯度實驗,DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。,

3、半保留復制的概念,按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。,半保留復制的意義,遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，但不是絕對的。,原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。,二、雙向復制,A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B. 復制中的兩個復制叉C. 復制接近終止點(termination, ter),

4、真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon) 。復制子是獨立完成復制的功能單位。,真核生物,5’,5’,3’,3’,,,,,5’,5’,3’,,,,,,,,復制子,,,,3’,三、復制的半不連續(xù)性,領頭鏈(leading strand),隨從鏈(lagging strand),順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領頭鏈。另一股鏈因為復制的方向

5、與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。,DNA復制的酶學The Enzymology of DNA Replication,第二節(jié),參與DNA復制的物質(zhì),底物(substrate): dNTP聚合酶(polymerase): 依賴DNA的DNA聚合酶，

6、 簡寫為 DNA-pol模板(template) : 解開成單鏈的DNA母鏈(ssDNA）引物(primer): 提供3?-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白質(zhì)因子,一、復制的化學反應,(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi,聚合反應的特點,DNA 新鏈生成需引物和模板； 新鏈的延長只可沿5? → 3?方向進行 。,二、DNA聚合酶,全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DN

7、A-dependent DNA polymerase,DDDP)簡稱：DNA-pol,活性：1. 5??3? 的聚合活性2. 核酸外切酶活性,,,,,3? ? 5?外切酶活性,,,5? ? 3?外切酶活性,?,能切除突變的 DNA片段。,能辨認錯配的堿基對，并將其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ⅠDNA-pol ⅡDNA-pol Ⅲ,功能：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的

8、空隙進行填補。,DNA-pol Ⅰ（109kD）,復制產(chǎn)生短片斷的DNA,323個氨基酸,小片段,5? ? ??核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604個氨基酸,DNA聚合酶活性 ?? ? 5? 核酸外切酶活性,,,,N 端,C 端,DNA-pol Ⅰ,Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。,DNA-pol Ⅱ（120kD）,DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活。

9、它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。,功能是原核生物復制延長中真正起催化作用的酶。,DNA-pol Ⅲ(250kD),復制產(chǎn)生長片斷的DNA,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ?,起始引發(fā)，有引物酶活性。,延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。,參與低保真度的復制 。,在復制過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。,在線粒體DNA復制中起催化作用。,DNA-pol ?,DNA-pol ?,DNA-pol ?,DNA-pol ?,

10、三、復制保真性的酶學依據(jù),復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準確傳代的基本原理。復制保真性的酶學機制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀 （二）復制的保真性和堿基選擇,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀,A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。,（二）復制的保真性和堿基選擇,? DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫

11、鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。? 嘌呤的化學結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處于反式構(gòu)型。,1. 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；2. 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；3. 復制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。,DNA復制的保真性至少要依賴三種機制,四、復制中的分子解鏈及DNA 分子拓撲學變化,DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。,,,,,,,,,,,,,,,（

12、一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白,解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復制起始時催化生成RNA引物的酶,單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)——在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整,（二）DNA拓撲異構(gòu)酶(DNA topoisomerase),解鏈過程中正超螺旋的形成,拓撲異

13、構(gòu)酶作用特點既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵,拓撲異構(gòu)酶Ⅰ 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ,分 類,拓撲異構(gòu)酶Ⅰ,切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應不需ATP。,拓撲異構(gòu)酶Ⅱ,切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。,作用機制,五、DNA連接酶,連接DNA鏈3?-OH末端和相鄰DNA鏈5?-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而

14、把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。,DNA連接酶(DNA ligase)作用方式,,HO,5’,,3’,,3’,5’,,DNA連接酶,,ATP,ADP,,5’,3’,,5’,3’,,DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,（一）復制的起始,需要解決兩個問題：,1. DNA解開成單鏈，提供模板。,2. 合成引物，提供3?-OH末端。,一、原核生物

15、的DNA生物合成,E.coli復制起始點 oriC,1. DNA解鏈,1）復制起始點的識別,2）解螺旋酶解開雙鏈,4）SSB參與維持DNA的單鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,3） DNA拓撲異構(gòu)酶(可能主要是II型酶的作用)，在將要打結(jié)或已打結(jié)處作切口。,,,,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓撲異構(gòu)酶,,,,SSB,3?,5?,3?,5?,,,,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓撲異構(gòu)酶,,,,引物酶,SSB,3?,5?,3?,

16、5?,2. 引發(fā)體的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。,引物酶,復制是在一段RNA引物的基礎上進行的，催化引物合成的是一種RNA聚合酶，它不同于催化轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶，因此稱為引物酶。 DDRP —— DNA dependent RNA polymerase由于DDDP不可以催化兩個單dNTP之間的反應，DDRP可以催化兩個NTP起始合成小的RNA片斷引物酶合成的小的RNA片斷稱

17、為“引物”，為DNA的合成提供 3’－OH,,,,3?,5?,3?,5?,引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。,引物,引物酶,復制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行復制，在電子顯微鏡下均看到伸展成叉狀的復制現(xiàn)象，稱為復制叉。 在DNA聚合酶III的作用下，新鏈第一個脫氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯鍵。復制開始。,（二）復制的延長,復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐

18、個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。,,OH 3',3',領頭鏈的合成：DDDP沿著模板3’?5’滑動，第一個進入配對的dNTP與RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯鍵，留下3’－OH繼續(xù)合成,,隨從鏈的合成——岡崎片段的形成,兩條鏈是在同一個DNA-polⅢ的催化下進行延長的過程,階段一,階段二,階段三,階段四,原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段在復制的終止點(ter)處

19、匯合。,（三）復制的終止,隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接,復制過程簡圖,哺乳動物的細胞周期,DNA合成期,,,,,,,G1,G2,S,M,,,,,二、真核生物的DNA生物合成,? 細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關。 ? 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。,? 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動。

20、 ? 復制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replication factor, RF)。 ? 增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復制起始和延長中起關鍵作用。,（一）復制的起始,,,3?,5?,5?,3?,領頭鏈,3?,,,,,5?,3?,5?,親代DNA,,,,,,,,,,,,,,隨從鏈,引物,核小體,

21、（二）復制的延長,染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙。,,（三）復制的終止,,,,,,,,,,5?,3?,3?,5?,,,,,,,,,,,5?,3?,3?,5?,,,,,,,,,+,5?,3?,3?,3?,3?,5?,5?,端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。,,端粒酶(telome

22、rase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),組成,端粒酶的催化延長作用,爬行模型,,DNA聚合酶復制子鏈,進一步加工,端粒維持著染色體的穩(wěn)定。端粒因細胞分裂而變短到一定程度時，細胞就會死亡

23、。 端粒破損會導致DNA變得脆弱、容易發(fā)生變異，可能導致一些與衰老有關的疾病，如動脈硬化和某些癌癥。,逆轉(zhuǎn)錄和其他復制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四節(jié),逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase),逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription),一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶,逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象,逆轉(zhuǎn)錄酶有三種酶的活性：R

24、NA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性,,逆轉(zhuǎn)錄酶,,A A A A,T T T T,,,AAAA,,SI核酸酶,,,,DNA聚合酶Ⅰ,,,,堿水解,,,T T T T,,分子生物學研究可應用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。,以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。,試管內(nèi)合成cDNA,cDNA ?complementary DNA?,,逆轉(zhuǎn)錄酶,,,雙鏈D

25、NA,,整合,,,,,,宿主DNA,RNA病毒在細胞內(nèi)復制成雙鏈的DNA，稱為前病毒，前病毒可以獨立繁殖在某些條件下，前病毒的基因組通過基因重組，參加到細胞基因組內(nèi)，并且隨著宿主的基因一起復制和表達——整合前病毒獨立繁殖或者整合，都可成為致病的原因,反轉(zhuǎn)錄病毒細胞內(nèi)的復制,二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義,逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒

26、的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。,滾環(huán)復制(rolling circle replication),三、滾環(huán)復制和D環(huán)復制,是某些低等生物的復制形式，如?X174和M13噬菌體等。,,,,,,,,3?-OH,5?-P,,,,,,,,,5?,5?,5?,3?,3?,3?,3?,5',,滾環(huán)復制,,,,,,,5',??,5?,3?,,3?,5?,D環(huán)復制(D-loop replication),是線粒體DNA

27、 (mitochondrial DNA，mtDNA)的復制形式。,DNA損傷（突變）與修復DNA Damage (Mutation) and Repair,第五節(jié),遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。,在復制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNA damage)。,從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。,一、突變的意義,（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（

28、四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎,,,二、引發(fā)突變的因素,物理因素:紫外線(ultra violet, UV)、各種輻射,紫外線照射可引起核酸鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶形成二聚體TT（胸腺二聚體）。,化學因素,三、突變的分子改變類型,錯配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement),DNA分子上的堿基錯配稱點突變(point mutation)。,（一）錯配,鐮形紅細胞貧

29、血病人Hb (HbS) β亞基,正常成人Hb (HbA)β亞基,（二）缺失、插入和框移,缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。,插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。,框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。,缺失或插入都可導致框移突變。,缺失引起框移突變,（三）重排,DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。,由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型,四、DNA損傷的修

30、復,修復(repairing) 是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復為原有的天然狀態(tài)。,光修復(light repairing)切除修復(excision repairing)重組修復(recombination repairing)SOS修復,修復的主要類型,（一）光修復,,光修復酶(photolyase),,UV,光修復過程是通過光修復酶催化而完成的，需300－600nm波長照射激活,（二）切除修復,是細胞內(nèi)最重要和有效的

31、修復機制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。,E.coli的切除修復機制,（三）重組修復,這是DNA的復制過程中所采用的一種有差錯的修復方式。,(recombination repairing),DNA分子受到較大范圍損傷,使復制受到抑制時這種修復機制用SOS借喻細胞處于危急狀態(tài)。 損傷誘導一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。繼續(xù)催化損傷部位DNA的復制。 通過SOS修復，復制如能繼續(xù)，細胞是