DEHP和BaP聯(lián)合染毒對(duì)人張氏肝細(xì)胞EROD和ECOD酶活性及凋亡的影響.pdf

1、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)是廣泛用于食品包裝、化妝品、兒童玩具及醫(yī)療制品等產(chǎn)品的一種增塑劑。由于DEHP不以共價(jià)鍵形式而是物理結(jié)合于聚氯乙烯分子上,因而極易逸散到空氣、水和土壤等環(huán)境介質(zhì)。苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, BaP)是環(huán)境中有機(jī)物的不完全燃燒及熱分解過程的產(chǎn)物,在自然界中很難降解。環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示,DEHP和BaP普遍共存于各種環(huán)境介質(zhì)中。人

2、體可以通過消化道、呼吸道和皮膚接觸等途徑暴露于此兩種環(huán)境污染物。
　　研究表明,DEHP可引起生殖發(fā)育毒性等,近年研究又報(bào)道了DEHP的肝臟毒性。BaP作為最早被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境化學(xué)致癌物,同樣具有肝臟毒性。前期研究多報(bào)道DEHP和BaP單獨(dú)的肝臟毒性,但關(guān)于兩者聯(lián)合暴露對(duì)生物體的肝臟毒性作用鮮有報(bào)道。由于環(huán)境污染物對(duì)人體的健康效應(yīng)是多種污染物長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果,因此,DEHP與BaP共同作用而引起的不良健康效應(yīng)不容忽視。
　　外

3、源化合物進(jìn)入機(jī)體后,需在相關(guān)代謝酶的作用下進(jìn)行代謝。其中細(xì)胞色素P450酶系(Cytochrome P450 enzymes, CYP450s)是廣泛存在于生物體肝臟的Ⅰ相反應(yīng)代謝酶。BaP進(jìn)入機(jī)體后需經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系中CYP1A1酶代謝活化, DEHP進(jìn)入機(jī)體后可通過孕烷X受體途徑被CYP3A4酶代謝。乙氧基異吩惡唑酮-O-脫乙氧基酶(EROD, Ethoxyresorufin-O-deethylase)和7-乙氧香豆素-O-脫

4、乙基酶(ECOD,7-ethoxycoumarin-O-deethylase)實(shí)驗(yàn)已被廣泛用于評(píng)價(jià) CYP1A1和CYP3A4酶類活性。
　　細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程,包括內(nèi)源性和外源性兩種形式,其中線粒體途徑是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡的重要途徑之一。在受到外界環(huán)境因素刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)水平發(fā)生改變,線粒體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡遭到破壞,導(dǎo)致線粒體膜電位(mitochond

5、rial membrane potential, MMP)下降,并最終使細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可通過形成同源或異源二聚體影響線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。
　　已知許多環(huán)境污染物可致細(xì)胞凋亡。但是,有關(guān)環(huán)境污染物聯(lián)合作用對(duì)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究仍有限。鑒于此,本研究選取了人張氏肝細(xì)胞(Chang liver)為靶細(xì)胞,以DEHP和BaP為受試物,評(píng)價(jià)DEHP和BaP聯(lián)合染毒

6、對(duì)人張氏肝細(xì)胞活力,EROD和ECOD酶活性、ROS生成、線粒體膜電位以及凋亡相關(guān)蛋白 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響,為進(jìn)一步研究線粒體途徑在DEHP和BaP致細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用提供一定的科學(xué)線索。本研究分為兩部分:
　　第一部分 DEHP和BaP聯(lián)合染毒對(duì)人張氏肝細(xì)胞活力、EROD和ECOD酶活性的影響
　　目的:評(píng)價(jià)DEHP與BaP聯(lián)合染毒對(duì)Chang liver細(xì)胞活力、EROD和ECOD酶活性的影響。

7、>　　方法:用設(shè)定濃度的DEHP(62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)與BaP(64μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合染毒Chang liver細(xì)胞24h和48h。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,用化學(xué)熒光法檢測(cè)EROD和ECOD酶活性。
　　結(jié)果:較高濃度DEHP單獨(dú)染毒組(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)和所有DEHP與BaP的聯(lián)合染毒組細(xì)胞活

8、力降低(P<0.05或P<0.01)。在DEHP單獨(dú)染毒組未觀察到 EROD酶活性的變化,在24h觀察點(diǎn),較高濃度DEHP(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)單獨(dú)染毒組ECOD酶活性升高,而上述濃度DEHP與BaP(64μmol/L)聯(lián)合染毒組的EROD和ECOD酶活性均顯著性升高。在48h觀察時(shí)點(diǎn),125μmol/L及以上的DEHP單獨(dú)染毒組ECOD酶活性升高,聯(lián)合染毒各組的EROD和ECOD酶活性則均呈顯

9、著性升高(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論: DEHP與BaP聯(lián)合染毒引起Chang liver細(xì)胞活力降低;DEHP單獨(dú)染毒Chang liver細(xì)胞誘導(dǎo)ECOD酶活性升高(P<0.05或P<0.01);DEHP與BaP聯(lián)合染毒則誘導(dǎo)了EROD和ECOD酶活性均顯著性升高(P<0.01)。
　　第二部分DEHP和BaP聯(lián)合染毒人張氏肝細(xì)胞對(duì)線粒體介導(dǎo)凋亡的影響
　　目的:重點(diǎn)研究DEHP與BaP聯(lián)合染毒人張氏

10、肝細(xì)胞對(duì)線粒體介導(dǎo)的凋亡的影響。
　　方法:用設(shè)定濃度的DEHP(62.5μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)與BaP(64μmol/L)單獨(dú)或聯(lián)合染毒Chang liver細(xì)胞24h和48h。2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。羅丹明123染色檢測(cè)線粒體膜電位。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。用實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因bax, bcl-2和ca

11、spase-3的表達(dá)水平。用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)量。
　　結(jié)果: DEHP與BaP聯(lián)合染毒誘導(dǎo)了靶細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高,且均高于相應(yīng)的DEHP單獨(dú)染毒組(P<0.05或P<0.01)。與相應(yīng)濃度的DEHP單獨(dú)染毒組比,較高濃度DEHP(250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)與64μmol/L BaP聯(lián)合染毒靶細(xì)胞24h,引起了線粒體膜電位降

12、低和細(xì)胞凋亡率的升高(P<0.01)。此外,還檢出活化Caspase-3的高表達(dá),bax/bcl-2和Bax/Bcl-2比值的升高;在48h觀察點(diǎn),≥125μmol/L的DEHP與64μmol/L Bap聯(lián)合染毒組亦呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)。
　　結(jié)論:一定濃度的DEHP(125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1000μmol/L)與64μmol/L的BaP聯(lián)合染毒Chang liver細(xì)胞,促發(fā)ROS水平升高和線粒