苯吸入對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞凋亡及HDAC酶活性的影響.pdf

1、目的：苯與人們的工作生活息息相關(guān)，它對(duì)人體產(chǎn)生的危害受到了全世界的關(guān)注，為一種明確的致癌物質(zhì)，近年來(lái)人們致力于苯接觸對(duì)人體產(chǎn)生毒害的研究[1]。骨髓細(xì)胞是苯誘導(dǎo)產(chǎn)生毒性的靶器官之一，體外研究顯示[2,3]口苯及其代謝產(chǎn)物如氫醌可引起人骨髓細(xì)胞的凋亡及DNA加合物形成，并可引起表觀遺傳學(xué)改變，通過(guò)影響TOPOⅡα啟動(dòng)子相關(guān)基因的甲基化和組蛋白的乙?；揎?，改變其拓?fù)渥饔?，影響基因的正常轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和蛋白的翻譯，最終遺傳學(xué)改變。同時(shí)大量的苯中

2、毒動(dòng)物模型[4-6]《研究顯示在體內(nèi)苯及其代謝物也可引起骨髓細(xì)胞的凋亡，致外周血三系明顯下降，對(duì)組織器官產(chǎn)生各種氧化應(yīng)激損傷，以及對(duì)DNA的損傷，本課題組旨在進(jìn)一步研究苯在小鼠體內(nèi)致小鼠造血系統(tǒng)損傷是否是通過(guò)影響組蛋白乙酰化修飾造成的。
　　1、觀察苯吸入誘導(dǎo)造血系統(tǒng)毒性的小鼠模型情況。
　　2、觀察不同濃度苯吸入后對(duì)CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　3、觀察苯吸入后對(duì)CD1雄性小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的組蛋白去乙

3、酰化酶(HDAC)活性的影響。
　　方法：(1)自制動(dòng)式苯吸入裝置:取50ml無(wú)菌注射器抽取分析純苯35ml左右，置于便攜式微量注射泵上，調(diào)節(jié)參數(shù)為20ml模式下，速度8-9mm/小時(shí)，通過(guò)一軟管針頭滴注入一個(gè)250ml棕色玻璃瓶橡膠塞內(nèi)，并連接一個(gè)小量程氣泵提供帶苯入裝置的氣流;玻璃瓶橡膠塞上另接出一塑料軟管連接進(jìn)入100L塑料箱中;再取一根連接電磁式空氣壓縮機(jī)的橡膠軟管也接入100L塑料箱中，提供給小鼠呼吸的氧氣，并可以通過(guò)內(nèi)

4、嵌在塑料箱中的風(fēng)扇將苯氣體帶入塑料箱內(nèi);在第一個(gè)箱子排氣孔處用直徑20cm的塑料軟管連接另一個(gè)相同的塑料箱，并從連接電磁式空氣壓縮機(jī)的橡膠軟管中分接一根橡膠軟管接入第二個(gè)塑料箱中，通過(guò)內(nèi)嵌的風(fēng)扇提供該裝置內(nèi)小鼠氧氣及帶動(dòng)第一個(gè)箱子排進(jìn)來(lái)的苯氣體，裝上空氣調(diào)節(jié)閥以調(diào)控進(jìn)入兩個(gè)塑料箱的空氣量以便調(diào)整兩個(gè)箱子內(nèi)苯濃度。啟動(dòng)整套裝置時(shí)，用膠帶將整個(gè)裝置密封，接出一根塑料管供苯濃度檢測(cè)儀監(jiān)控裝置內(nèi)氣體中苯濃度。
　　(2)造模及實(shí)驗(yàn)方法:8

5、-9周齡CD1雄性小鼠在裝置中吸入苯氣體，6小時(shí)/天，5天/周，300ppm維持3個(gè)月;900ppm維持3個(gè)月。末次吸苯第二天用摘眼球取血法將正常對(duì)照組和苯吸入實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠處死;并分離雙側(cè)股骨及脛骨，用1ml注射器沖洗骨髓腔，獲得部分骨髓細(xì)胞進(jìn)行流式骨髓細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
　　(3)將其余骨髓細(xì)胞使用小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞核蛋白，檢測(cè)核蛋白濃度，將目的蛋白濃度過(guò)低的進(jìn)行蛋白濃縮，應(yīng)用去乙?；?/p>

6、(HDAC)試劑盒檢測(cè)HDAC酶活性變化。
　　結(jié)果：1、①300ppm，3個(gè)月苯吸入模型組小鼠的白細(xì)胞，血紅蛋白，血小板，脾體指數(shù)均較正常對(duì)照組明顯下降，與正常對(duì)照組相比分別下降了78.1％，34.2％,15.23％,60.6％(P＜0.05)。
　　②900ppm，3個(gè)月苯吸入模型組小鼠的白細(xì)胞，血紅蛋白，血小板，脾體指數(shù)均較正常對(duì)照組明顯下降，與正常對(duì)照組相比分別下降了82.7％，29.9％,52.6％,60.8％。(

7、P＜0.05)
　　苯吸入模型小鼠肝臟病理結(jié)果顯示肝造血細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多，肝細(xì)胞脂肪變性，胞漿疏松等病理改變;脾臟病理結(jié)果顯示脾臟萎縮，造血組織減少等改變。各項(xiàng)指標(biāo)均提示苯誘導(dǎo)小鼠造血系統(tǒng)毒性模型制作成功。（以上各項(xiàng)具體結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)同課題組，陳楓煜同期論文《苯致小鼠再生障礙性貧血模型的建立及對(duì)HDAC基因表達(dá)的影響》）。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡情況，流式結(jié)果顯示:
　　A、300ppm濃度苯吸入結(jié)果:

8、
　　(1)①300ppm濃度批正常對(duì)照組CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+PI-）細(xì)胞比例8.33±0.61％;300ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI-)細(xì)胞比例13.8±5.31％。實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+PI-）細(xì)胞比例是正常小鼠的1.65倍。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　?、?00ppm濃度批正常對(duì)照組CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例2.5

9、3±0.9％;300ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例2.80±0.55％。組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　B、900ppm濃度苯吸入結(jié)果:
　　(2)①900ppm濃度批正常CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+PI-）細(xì)胞比例7.16±2.18％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI-)細(xì)胞比例13.1±5.39％。實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+P

10、I-）細(xì)胞比例是正常小鼠的1.83倍。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　?、?00ppm濃度批正常對(duì)照組CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例4.54±0.84％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例7.11±3.54％。實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞比例是正常小鼠的1.57倍。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　C、300ppm與900ppm濃度兩組間進(jìn)行比較:

11、>　　(1)300ppm濃度本吸入小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+PI-）細(xì)胞比例13.8±5.31％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞（AnnexinⅤ+PI-）細(xì)胞比例13.1±5.39％，兩者之間進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)300ppm濃度本吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例2.80±0.55％;900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞(AnnexinⅤ+PI+)細(xì)胞比例7.27±

12、3.59％，兩者之間進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組是正常組2.59倍，P＜0.05，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、正常CD1雄性小鼠骨髓細(xì)胞組蛋白HDAC酶活性5.0±1.52×10-3(OD值/μg);900ppm濃度苯吸入小鼠骨髓細(xì)胞組蛋白HDAC酶活性7.89±2.58×10-3（OD值/μg）。實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓細(xì)胞HDAC酶活性是正常小鼠的1.58倍，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、成功建立安全有效的苯吸入誘導(dǎo)CD