偶氮染料的生物毒性及其與生物大分子的結(jié)合作用.pdf

1、染料的毒性，特別是偶氮染料的致毒作用，已經(jīng)引起各國(guó)政府的高度關(guān)注。如何快速評(píng)價(jià)偶氮染料對(duì)生態(tài)環(huán)境的毒性效應(yīng)，減少其對(duì)環(huán)境及人類(lèi)的危害，已成為急待研究的課題。染料分子可通過(guò)多種途徑被人體吸收，并引起某種生物學(xué)作用。特別是在靶部位與關(guān)鍵性生物大分子的結(jié)合，可引起生物大分子各種結(jié)構(gòu)和功能的異常，而發(fā)生毒負(fù)作用。近年來(lái)，關(guān)于污染物不良效應(yīng)的研究，已經(jīng)深入到以生物大分子作為污染物作用的靶位點(diǎn)，從而使人們對(duì)于污染的認(rèn)識(shí)及其評(píng)價(jià)更為明確，也為污染物的

2、防治提供更為科學(xué)的依據(jù)。本論文從兩個(gè)層面對(duì)三種偶氮染料的毒性進(jìn)行了研究。用發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)了它們的急性毒性，并對(duì)致毒的機(jī)理進(jìn)行了研究。通過(guò)三種染料與人血清白蛋白的結(jié)合機(jī)理和與DNA結(jié)合模式、親和力大小以及對(duì)DNA堿基序列特異性識(shí)別的研究，預(yù)測(cè)其對(duì)人類(lèi)潛在的危害。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.利用發(fā)光菌法評(píng)價(jià)了三種偶氮染料的急性毒性，應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)測(cè)定了染料作用前后發(fā)光細(xì)菌體內(nèi)生物大分子特征拉曼位移，并對(duì)發(fā)光菌與C.I.酸性

3、紅73接觸前后特征拉曼位移的變化進(jìn)行了詳細(xì)指認(rèn)。實(shí)驗(yàn)表明，在所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)三種偶氮染料均有一定的毒性。其毒性從大到小的順序是：C.I.酸性紅73>C.I.酸性藍(lán)113>C.I.活性紅24。其中，C.I.酸性紅73毒性最大，當(dāng)濃度為100 mg/L，與發(fā)光細(xì)菌作用15分鐘后，其發(fā)光擬制率為26.9％，毒性大小相當(dāng)于氯化汞濃度為0.061mg/L時(shí)毒性，并隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，毒性增加。拉曼光譜也表明，三種偶氮染料和發(fā)光菌接觸后，與其生物大

4、分子發(fā)生了結(jié)合，或者使這些生物大分子所處的微環(huán)境發(fā)生了變化，導(dǎo)致了其特征拉曼峰的強(qiáng)度和位置發(fā)生不同程度的改變，影響到發(fā)光菌正常的生理代謝功能，表現(xiàn)在發(fā)光強(qiáng)度的降低。
　　 2.應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)，研究了還原黃素單核苷酸(FMNH2)與菌熒光素酶的最佳結(jié)合部位位點(diǎn)。完成了FMNH2和熒光素酶三個(gè)區(qū)域(即α亞基、β亞基和兩個(gè)亞基的交界面處)的分子對(duì)接研究。根據(jù)FMNH2與菌熒光素酶每個(gè)區(qū)域的的最低結(jié)合能，識(shí)別了兩個(gè)活性位點(diǎn)，一個(gè)在α亞

5、基，命名為活性位點(diǎn)Ⅰ(activesite-Ⅰ)，這個(gè)活性位點(diǎn)與已報(bào)道的大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。另一個(gè)是在兩個(gè)亞基交界面處，命名為活性位點(diǎn)Ⅱ(active site-Ⅱ)。FMNH2在這兩個(gè)活性部位的最低結(jié)合能分別為：-32.4 KJ mol-1(活性位點(diǎn)Ⅱ)和-31.2 KJ mol-1(活性位點(diǎn)Ⅰ)，表明兩個(gè)活性位點(diǎn)具有近似的親合力?；钚晕稽c(diǎn)Ⅱ的提出，有助于理解為什么雜二聚體的催化活性高于單個(gè)亞基的催化活性；為研究化學(xué)污染物對(duì)細(xì)菌發(fā)光

6、抑制機(jī)理提供理論依據(jù)；也為基因突變研究和分子動(dòng)力學(xué)模擬提供一些基礎(chǔ)信息。
　　 3.應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)，完成了細(xì)菌催化發(fā)光反應(yīng)的底物長(zhǎng)鏈脂肪醛和三種染料在熒光素酶兩個(gè)活性位點(diǎn)的分子對(duì)接模擬，計(jì)算出每種物質(zhì)在兩個(gè)活性位點(diǎn)的最低結(jié)合能。通過(guò)對(duì)比結(jié)合能的大小，分析了三種染料抑制細(xì)菌發(fā)光的分子機(jī)制。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明，C.I.酸性紅73與底物黃素單核苷酸相比，在兩個(gè)活性位點(diǎn)都不具備競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，但是能抑制底物長(zhǎng)鏈脂肪醛在兩個(gè)活性位點(diǎn)的結(jié)合，應(yīng)具

7、有較強(qiáng)的細(xì)菌發(fā)光抑制效應(yīng)。而C.I.酸性藍(lán)113和C.I.活性紅24在活性位點(diǎn)Ⅰ都具有較強(qiáng)的親和力，能抑制酶與兩種底物在活性位點(diǎn)Ⅰ的結(jié)合；但是在活性位點(diǎn)Ⅱ的的親和力較差，結(jié)合能均為正值，而不能抑制它們?cè)诨钚晕稽c(diǎn)Ⅱ的結(jié)合，對(duì)細(xì)菌的發(fā)光抑制率應(yīng)較小。這與細(xì)菌發(fā)光抑制實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果是一致的。
　　 4.應(yīng)用熒光光譜、紫外光譜、園二色譜和分子對(duì)接技術(shù)，研究了三種染料與人血清白蛋白結(jié)合的分子機(jī)理。理論和實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果表明，三種染料與蛋白質(zhì)

8、之間具有較高的親和力，能自發(fā)結(jié)合形成配合物。疏水作用是主要的作用力類(lèi)型，而氫鍵和靜電作用對(duì)于形成穩(wěn)定的染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物也起到重要作用。另外染料與白蛋質(zhì)的結(jié)合還誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了微弱變化。
　　 分子對(duì)接的結(jié)果顯示，兩種酸性染料C.I.酸性紅73和C.I.酸性藍(lán)113與蛋白質(zhì)最可能的結(jié)合位點(diǎn)在蛋白質(zhì)第一結(jié)構(gòu)域的Ⅰ B亞域；給體(Trp214)與受體(染料)之間的平均距離分別為3.06和2.82 nm，與實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果3.

9、28 nm(C.I.酸性紅73)和2.78(C.I.酸性藍(lán)113)是非常接近的。而活性染料C.I.活性紅24主要結(jié)合在蛋白質(zhì)第二結(jié)構(gòu)域的Ⅱ A亞域；Trp214與C.I.活性紅24之間的平均距離為1.18 nm，而通過(guò)Forster能量轉(zhuǎn)移理論求得的作用距離為3.11 nm，二者存在一定的誤差。可能的原因是：(1)C.I.活性紅24分子中含有較多的活性基團(tuán)，包括帶負(fù)電的三個(gè)磺酸基(-SO3)、兩個(gè)氯原子(-Cl)和一個(gè)羥基(-OH)，帶

10、正電的仲胺和一個(gè)三嗪環(huán)，這些活性基團(tuán)使的該染料分子易與蛋白質(zhì)的堿性或酸性氨基酸結(jié)合，而不能進(jìn)入所研究的四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；(2)亞域ⅡA是C.I.活性紅24最佳的結(jié)合位點(diǎn)，但是仍會(huì)有部分染料分子結(jié)合在其它幾個(gè)亞域。通過(guò)Forster能量轉(zhuǎn)移理論求出的作用距離應(yīng)為C.I.活性紅24的各結(jié)合位點(diǎn)與蛋白質(zhì)色氨酸殘基(Trp214)之間距離的平均值；其它原因需要做進(jìn)一步研究。
　　 研究結(jié)果表明，三種染料中，C.I.酸性紅73與蛋白質(zhì)具有最低

11、的結(jié)合自由能△G(實(shí)驗(yàn)值)和最大的結(jié)合常數(shù)Kb，這與其具有最大的生物毒性(抑制細(xì)菌發(fā)光)是一致的。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，可能會(huì)影響到生物體內(nèi)重要物質(zhì)的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，與它們形成競(jìng)爭(zhēng)，干擾正常的生理功能，導(dǎo)致生物毒性的發(fā)生。所以，通過(guò)研究染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，計(jì)算它們結(jié)合力的大小和結(jié)合位點(diǎn)，來(lái)預(yù)測(cè)它們的生物毒性是可行的。
　　 5.應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)，研究了這三種染料與9個(gè)DNA片段的結(jié)合模型和對(duì)DNA序列的選擇性。分子對(duì)接結(jié)果表明，小溝槽

12、結(jié)合是三種染料與正常的DNA片段(沒(méi)有插入縫隙)結(jié)合的主要結(jié)合模式。即使DNA片段中存在插入縫隙，小溝槽結(jié)合也可能是部分染料的優(yōu)先結(jié)合模式。在研究的九個(gè)不同堿基序列的DNA片段中，十二聚體d(CGCGATATCGCG)2(PDB ID：1DNE)是酸性紅C.I.73最佳的結(jié)合對(duì)象，具有最低的結(jié)合自由能(-9.19 kcal/mol.)；六聚體d(CGATCG)2(PDBID：123F)是C.I.酸性藍(lán)113最佳的結(jié)合靶標(biāo)，具有最低的結(jié)合

13、自由能(-11.8kcal/mol.)；含有兩個(gè)插入縫隙的四聚體d(CGCG)，(PDB ID：1D32)的小溝槽是C.I.活性紅24最佳的結(jié)合靶標(biāo)，具有最低的結(jié)合自由能(-8.13 kcal/mol)。結(jié)合模型分析表明，三種染料中，只有C.I.酸性紅73分子中的萘二磺酸部分對(duì)DNA小溝槽的CG堿基序列具有選擇性，而其它兩種染料沒(méi)有明顯地表現(xiàn)出堿基序列的選擇性。
　　 研究表明，三種染料與DNA的親合力大小跟與小溝槽結(jié)合的芳香基

14、團(tuán)的數(shù)目有關(guān)，芳環(huán)越多親合力越大。由于C.I.酸性藍(lán)113比其它兩種染料具有更多的芳香基團(tuán)與小溝槽結(jié)合，能與DNA小溝槽形成更大的π鍵堆積。所以除了一個(gè)十二聚體d(CGCGATATCGCG)2(PDB ID：1DNE)外，C.I.酸性藍(lán)113與其它8個(gè)DNA片段的結(jié)合，都具有最強(qiáng)的結(jié)合能力。這是否表明該種染料具有較強(qiáng)的基因毒性，還需要做更深入的研究。DNA大溝槽是結(jié)合蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，研究發(fā)現(xiàn)，有部分構(gòu)象的染料分子結(jié)合在DNA大溝槽中。如果