生物大分子與小分子相互作用研究.pdf

1、蛋白質是細胞內重要的生物大分子、功能分子，它具有運載和儲存功能，其生物功能與其特定結構密切相關，在所有的生命過程中起著關鍵的作用。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，藥物進入血漿后，首先與血清白蛋白結合，然后再被運送到身體的各部位發(fā)揮藥效。從分子水平上研究血清蛋白與藥物小分子的相互作用，有助于了解藥物的轉運和代謝過程，可以為高活性藥物小分子的設計與開發(fā)提供有價值的信息。
　　 在分子水平上闡明這些生物大分子與小分子、離子

2、，特別是靶向藥物分子的相互作用，是當前生命科學、臨床醫(yī)學、藥物化學及化學等許多領域的熱門研究課題。本論文是浙江省自然科學基金資助項目(N0．202056)“抗癌藥物與血清白蛋白、DNA的相互作用研究”和國家自然科學基金資助項目(N0．20273061)“氨基酸在模擬體液中的熱力學性質研究”的部分工作，其主要內容由以下幾部分工作組成：
　　 1．綜合應用多種方法研究了血清蛋白與喹諾酮類藥物的結合反應及作用機制，研究方法文中得到了進

3、一步的拓展。在研究方法上分別應用了紫外光譜法、熒光光譜法、同步熒光光譜法、三維熒光光譜法、三維偏振熒光光譜法、共振Rayleigh散射法及毛細管電泳法，從不同角度對所涉及體系進行研究，充分發(fā)揮了每種方法的優(yōu)勢，各方法相互補充、相互印證，較全面反應了喹諾酮藥物與所研究靶標生物大分子的結合反應。
　　 2．利用紫外—可見吸收光譜、熒光猝滅光譜和同步熒光光譜等技術，研究了pH=7.36的Tris—HCl緩沖溶液中鹽酸洛美沙星(LMFX

4、)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，研究了不同溫度下LMFX與HSA的猝滅情況，分別用Stern—Volmer方程和Scatchard法、Lineweaver—Burk雙倒數(shù)方程、雙對數(shù)方程等模型進行處理，并利用熱力學公式推導了兩者之間的相互作用力。研究表明，在實驗濃度范圍內和300、310K溫度下，LMFX與HSA可相互作用形成復合物；熒光猝滅作用符合靜態(tài)猝滅作用特征；并得到了相互作用的相關參數(shù)，結合常數(shù)KA為104～105L·mo

5、l—1，說明HsA對該藥物有中等強度的親和性；結合位點數(shù)大于1，因而LMFX可被人血清白蛋白貯存和運輸。其中該結合反應用雙對數(shù)方程處理，線性吻合更好，得到ΔG＜0，ΔH＜0，ΔS＜0，故鹽酸洛美沙星與HSA之間的作用主要是氫鍵或者范德華力作用，且反應能自發(fā)進行。此外，LMFX會導致人血清蛋白色氨酸殘基附近微環(huán)境極性增加，疏水性略有降低，使得人血清白蛋白的肽鏈伸展。根據(jù)F(o)ster偶極一偶極非輻射能量轉移原理，計算得到HSA中色氨酸殘

6、基與已結合的鹽酸洛美沙星分子間的距離為2.85nm，小于7nm，符合能量轉移理論，說明在鹽酸洛美沙星與HSA之間發(fā)生了能量轉移。
　　 3．用熒光光譜法、共振Rayleigh散射研究了金屬離子對HAS—LMFX間結合反應的影響，F(xiàn)e3+會改變LMFX藥物與HSA結合體的構象，促使共振Rayleigh散射強度明顯增大。結果表明，F(xiàn)e3+能和LMFX與HSA結合，引起熒光猝滅，共振瑞利散射強度大大增強，其熒光猝滅程度(△F)以及RR

7、S增強的程度(ΔI(RRS))均與Fe3+的濃度成正比，反應具有高靈敏度。共振Rayleigh散射技術是二十世紀九十年代發(fā)展起來的一種分析技術，由于其在研究生色團與生物大分子的聚集作用以及具有相反電荷的離子之間的離子締合作用時顯示出高的靈敏度和選擇性，特別是對于生物大分子的一些非鍵合作用特別敏感，而成為生物大分子的測定和表征的一種非常有用的技術。
　　 4．利用三維熒光、三維偏振熒光光譜技術研究了人血清白蛋白(HSA)與鹽酸洛美

8、沙星(LMFX)、甲磺酸培氟沙星(PFLX)、司帕沙星(SPFX)和加替沙星(GTFX)四種喹諾酮藥物非共價結合作用前后自身熒光強度、偏振度P以及各向異性值r的變化，及對其構象的影響。由相應的熒光指紋圖譜得到的熒光峰位置、熒光強度、Stokes位移等指紋信息，說明HSA的色氨酸殘基處于蛋白質內部的疏水區(qū)域，所處周圍微區(qū)環(huán)境性質由于藥物分子的插入引起較大的變化，極性明顯增強，從而導致HSA構象的改變，引起其三維熒光光譜發(fā)生較大的變化，熒光

9、峰紅移，Stokes位移增大，熒光強度降低；同時，由相互作用后的熒光偏振度P及各向異性r的增大，定量地證明HSA與喹諾酮藥物之間確實發(fā)生了相互結合反應。
　　 5．利用熒光猝滅法和動態(tài)光散射法測定尿素—水混合溶劑中牛血清白蛋白(BSA)與熒光素的結合距離和BSA的流體動力學半徑，并通過分析BSA和熒光素在BSA—尿素—水和熒光素—尿素—水三元體系以及BSA—熒光素—尿素—水四元體系中熒光光譜的變化，探討尿素與蛋白質分子在水溶液中

10、相互作用的機理及其對蛋白質構象的影響。結果顯示，BSA的3個結構域在尿素—水混合溶劑中具有不同的穩(wěn)定性，其中結構域Ⅲ在尿素—水混合溶劑中是不穩(wěn)定的，而結構域Ⅰ和結構域Ⅱ分別在尿素濃度大于3.0和4.0 mol·L—1的混合溶劑中發(fā)生去折疊。試驗發(fā)現(xiàn)，BSA結構域Ⅱ在低于去折疊濃度的尿素—水混合溶劑中形成更為緊密的構象，這一現(xiàn)象可以歸因于尿素與BSA結合引起的“蛋白質粘稠效應”。
　　 6．利用Anton Paar DMA55精密

11、數(shù)字密度計測定了288.15，298.15和308.15 K甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰甘氨酰甘氨酸在蔗糖—水混合溶劑中的密度，計算了它們的表觀摩爾體積Vφ和極限偏摩爾體積Vφ°，得到了其由純水溶劑轉移至混合溶劑中的遷移偏摩爾體積△trsVφ°和理論水化數(shù)Nh。根據(jù)共球交蓋模型，討論了遷移偏摩爾體積和水化數(shù)的變化規(guī)律。結果表明，這些模型化合物帶電中心與蔗糖之間的結構相互作用對其遷移體積有正貢獻，且占主導地位。模型化合物的遷移偏摩爾體積為