造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者的hla基因分型

1、主要工作流程,一、各“工作站”將審核、遴選合格的造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者血樣（貼有骨髓條碼），以及捐獻(xiàn)者樣本清單（捐獻(xiàn)者姓名及骨髓編號），一并送達(dá)我研究所免疫遺傳實(shí)驗(yàn)室；二、免疫遺傳實(shí)驗(yàn)室對捐獻(xiàn)者血樣進(jìn)行HLA-A、B和DRB1基因定型，對送檢血樣的HLA基因定型結(jié)果負(fù)責(zé)； 三、出具“捐獻(xiàn)者HLA基因分型檢測結(jié)果”報(bào)告。,主要內(nèi)容,（1）捐獻(xiàn)者HLA基因定型血樣的運(yùn)輸 （2）HLA相關(guān)基本概念 （3）HLA分

2、型（定型）技術(shù) HLA血清學(xué)分型技術(shù) HLA基因分型技術(shù),捐獻(xiàn)者HLA基因定型血樣的運(yùn)輸,注意事項(xiàng)：1、因“登記表”中填寫的內(nèi)容審核不合格血樣、以及經(jīng)HBV等化驗(yàn)檢查健康不合格的血樣，予以剔除；2、檢查血樣管有無破管；3、路途遠(yuǎn)、條件許可，可放置適量干冰；4、由專人運(yùn)送，防震、防顛覆；5、合格的HLA基因定型血樣與捐獻(xiàn)者樣本清單一并送往組織配型實(shí)驗(yàn)室。,人類白細(xì)胞抗原(Human L

3、eucocyte Antigen, HLA),1958年，Dausset采用白細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，檢測出第一個(gè)人類白細(xì)胞 抗原Mac（A2）。為高度復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，每個(gè)人的HLA千差萬別，即人體生物學(xué)的“身份證” ， 不同的民族、同一民族不同的地域，HLA基因及單倍型分布有其特點(diǎn)，HLA為人類主要組織相容性系統(tǒng)（MHC），與移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)，又稱移植抗原。是機(jī)體“識別自身”、“排除異已”的主要遺傳標(biāo)記，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4、HLA基因家族位于人類第6號染色體短臂，全長3.6 Mb，HLA基因家族是迄今為止最復(fù)雜、多態(tài)性最豐富、免疫功能相關(guān)基因最集中、與疾病關(guān)聯(lián)最密切的一個(gè)區(qū)域。,HLA抗原的分類,HLA-I類：由一條具有多態(tài)性的α多肽鏈和一條沒有多態(tài)性的?2微球蛋白通過非共價(jià)鍵組成異二聚體。 經(jīng)典HLA-I類抗原：包括HLA-A、B、C位點(diǎn)抗原，分布于幾乎所有有核細(xì)胞表面上。如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等，血小板上吸附HLA-A、B抗原。 非經(jīng)典H

5、LA-I類抗原：包括HLA-E、G 、F位點(diǎn)抗原，抗原在特定時(shí)間選擇性分布。HLA-II類：由34KD的? 鏈和29KD的β鏈以非共價(jià)鍵連接而成，包括HLA-DR、DP、DQ抗原； 僅分布于B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞表面。HLA-Ⅲ類：主要包括補(bǔ)體分子C2、C4及Bf等。,HLA抗原結(jié)構(gòu),HLA的免疫原性及骨髓庫建庫工作中常規(guī)檢測的HLA位點(diǎn),HLA是一個(gè)高度復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，如： 經(jīng)典HLA-

6、I類抗原：HLA-A、B、C位點(diǎn)抗原； 非經(jīng)典HLA-I類抗原：HLA-E、G 、F位點(diǎn)抗原 HLA-II類：HLA-DR、DP、DQ位點(diǎn)抗原HLA的免疫原性，主要以HLA-A、B和DRB1的免疫原性較強(qiáng)，因此，骨髓庫建庫工作中，通常僅對HLA-A、B和DRB1位點(diǎn)進(jìn)行定型。無關(guān)供者骨髓移植中，NMDP、JMDP有研究資料表明，供/受者對HLA-CW基因的匹配程度，與GVHD、移植成活率相關(guān)。,HLA基因,定

7、位于人類第6號染色體短臂（6p21.31），全長3.6 Mb，占人類基因組堿基數(shù)的0.1%。HLA-I類基因：有10個(gè)遺傳座位，靠近染色體頂端，HLA-A、B、C、E、G、 F為表達(dá)基因，H、J、K、L為假基因，無基因產(chǎn)物。 HLA-Ⅱ類基因：靠近染色體著絲粒端，主要包括HLA-DR、DP、DQ基因座。,HLA基因結(jié)構(gòu),體細(xì)胞為二倍體，同源染色體之間相互配對，每一HLA位點(diǎn)有2個(gè)等位基因，一個(gè)來自于母親，另一個(gè)來自于父親。

8、檢測HLA-A、B和DRB1三個(gè)位點(diǎn)，有6個(gè)等位基因，即6個(gè)HLA分型數(shù)據(jù)。,檢出的HLA抗原及等位基因,2003年世界衛(wèi)生組織（WHO）HLA因子命名委員會命名的HLA等位基因： HLA座位 等位基因 特異性 HLA-A 250

9、 24 HLA-B 490 49 HLA-Cw 119 13 HLA-DRB1 315

10、 17 HLA-DPB1 99 6 HLA-DQB1 53 7HLA 系統(tǒng)等位基因豐富，每個(gè)人的等位基因型千差萬別，可以說在隨機(jī)人群中，難以有完全相同的。,HLA的命名,1、血清

11、學(xué)命名：遺傳位點(diǎn)后用數(shù)字表示，如A1、A2、A3、B5等。 以大寫字母A、B、C…表示HLA的遺傳座位；HLA特異性以數(shù)字表示；除HLA-A、B位點(diǎn)抗原的特異性的命名數(shù)字不重復(fù)外，其它位點(diǎn)抗原連續(xù)獨(dú)立命名；C位點(diǎn)抗原以Cw為字首命名，以和補(bǔ)體系統(tǒng)區(qū)別。2、HLA等位基因命名原則：位點(diǎn)后加“*”，再加數(shù)字表示。如DRB4*01 03 1 02 N 第1、2位數(shù)表示HLA抗原的特異性，第3、4位數(shù)表示等位基因（亞型），

12、結(jié)尾加N表示無效等位基因或不表達(dá)基因。 HLA等位基因所對應(yīng)的血清學(xué)特異性，可查閱過WHO公布的HLA字典。 HLA低分辨水平基因定型：確定HLA基因前2位數(shù)。HLA高分辨水平基因定型：確定HLA基因第4位以后的數(shù)字。,HLA的生物學(xué)功能,HLA參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，與抗原肽結(jié)合形成HLA-抗原肽復(fù)合物，抗原提呈細(xì)胞將此復(fù)合物交由T淋巴細(xì)胞處理，T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體（TCR）能夠?qū)乖岢始?xì)胞上的HLA-抗原肽復(fù)合物產(chǎn)生雙識別，從而介

13、導(dǎo)免疫反應(yīng)。,T細(xì)胞受體對HLA-抗原肽復(fù)合物的雙識別作用,人類白細(xì)胞抗原（HLA）的應(yīng)用,HLA分型在骨髓和器官移植組織型法醫(yī)學(xué)親子鑒定和個(gè)體識別人類種群學(xué)安全輸血疾病相關(guān)聯(lián)的研究等領(lǐng)域（如HLA-B27）,HLA分型技術(shù),1、傳統(tǒng)的血清學(xué)和細(xì)胞學(xué)分型方法 因需要有活性的細(xì)胞、定型血清或分型細(xì)胞來源困難、分型準(zhǔn)確性較差等原因，已逐步被淘汰。 2、PCR為基礎(chǔ)的HLA基因分型技術(shù) 分型所需

14、要的血樣量少，不需要有活性的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、結(jié)果的準(zhǔn)確性高，易于質(zhì)控和準(zhǔn)標(biāo)化。HLA基因分型技術(shù)取代了血清學(xué)方法。 當(dāng)前的“中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫”的建庫技術(shù)，不同于以往的“中華骨髓庫”。前者采用基因定型技術(shù)檢測HLA-A、B、DRB1基因，后者采用血清學(xué)方法檢測HLA-A、B抗原。,“中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫”對捐獻(xiàn)者血樣HLA基因分型技術(shù)的要求,對HLA-A、B和DRB1進(jìn)行基因分型，分辨率達(dá)低分辨水平。結(jié)果既

15、報(bào)告每一樣本的基因型，同時(shí)報(bào)告對應(yīng)的特異性。通過各省級組織配型實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控，以及國家“HLA質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室”組織的室間質(zhì)控對HLA基因分型的準(zhǔn)確性進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。,HLA基因分型技術(shù),PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）PCR-SSO流式磁珠分析HLA測序分型（SBT）PCR-序列特異性寡核苷酸探針（PCR-SSOP）基因芯片技術(shù)參比鏈介導(dǎo)的構(gòu)象分析(RSCA) HLA單倍體基因測序,HLA基因分型的步驟,1、DNA提取

16、 2、PCR擴(kuò)增 3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 4、結(jié)果分析（判別受檢者HLA基因型） 5、HLA基因定型報(bào)告,PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型技術(shù),基本原理： 使用序列特異性引物（SSP）特異性擴(kuò)增HLA等位基因，電泳分離PCR擴(kuò)增

17、產(chǎn)物，根據(jù)是否存在PCR產(chǎn)物以及片段大小，確定相應(yīng)基因。 主要步驟： 1、DNA提取 2、PCR擴(kuò)增 3、瓊脂糖凝膠電泳檢測 4、結(jié)果分析,PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型技術(shù),PCR-序列特異性引物（PCR-SSP）分型技術(shù),特點(diǎn)：簡便、快速、直觀等，特別適合于尸腎移植的組織配型；所需設(shè)備簡單，易于開展；為常規(guī)采用的經(jīng)典HLA基因分型技術(shù)。應(yīng)用：適合于經(jīng)典HLA-Ⅰ、Ⅱ類分子的基因分型

18、分辨率：低分辯、高分辯基因分型水平。,PCR-SSO流式磁珠分析技術(shù),基本原理：以反向核酸雜交為基礎(chǔ)，雜交產(chǎn)物采用流式磁珠儀進(jìn)行自動檢測，為高通量HLA基因定型技術(shù)。,PCR-SSO流式磁珠分析技術(shù)的特點(diǎn)（一）,實(shí)驗(yàn)原理、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測等，與SSP分型技術(shù)不同。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記探針的磁珠直接加入PCR產(chǎn)物中，微量離心管（反應(yīng)板）置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行分子雜交；雜交產(chǎn)物用流式磁珠儀進(jìn)行自動進(jìn)樣檢測，用HLA

19、分析軟件確定HLA基因型。,流式磁珠分析技術(shù)的特點(diǎn)（二）,配合DNA全自動DNA提取儀及多個(gè)PCR基因擴(kuò)增儀，具有高通量、操作簡便、快速特點(diǎn)。適合骨髓庫、臍血庫大批量樣本的HLA基因分型工作?；诹魇酱胖榉治黾夹g(shù)，已有多家商品化、低分辯水平的HLA基因分型試劑盒?？捎糜贖LA-A、B、C、DRB1和DQB1座位的基因分型。,HLA測序分型（SBT）技術(shù),,HLA測序分型（SBT）技術(shù),國際公認(rèn)的HLA基因分型方法，高分辨率、高精

20、度；HLA測序分型技術(shù)較復(fù)雜，受實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件、試劑價(jià)格的限制，以往能夠開展HLA測序分型的實(shí)驗(yàn)室尚不多；隨著非血緣關(guān)系造血干細(xì)胞移植供/受者對HLA高分辯確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以及人類學(xué)研究、HLA與疾病相關(guān)聯(lián)等領(lǐng)域的需要，SBT技術(shù)的開展已日益增多。,HLA測序分型（SBT）技術(shù),可在同一PCR反應(yīng)條件、同一測序反應(yīng)的條件下，對不同HLA座位進(jìn)行同步擴(kuò)增，簡化了實(shí)驗(yàn)操作；隨著毛細(xì)管電泳基因測序儀及新的HLA分析軟件的應(yīng)用，HL