一種來自植物內(nèi)生芽胞桿菌的新型抗魔芋軟腐病菌蛋白.pdf

1、魔芋是單子葉多年生草本植物，其球莖中富含的葡萄甘露聚糖在食品、醫(yī)藥、化工和農(nóng)業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。軟腐病是魔芋的主要病害，造成魔芋產(chǎn)量嚴重不足，是魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要障礙。魔芋軟腐病的病原菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種。該病原菌除侵染魔芋之外，還能夠?qū)е掳撞?、花椰菜、蘿卜、番茄、辣椒、豆類等多種植物的軟腐病，是一種在世界范圍內(nèi)破壞性很大的重要病害。本研究從魔芋內(nèi)生菌中篩選具有生防應(yīng)用潛力的軟腐病原菌拮抗菌，研究其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)，期

2、望獲得新的抗病物質(zhì)；構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花魔芋遺傳轉(zhuǎn)化體系，將高絲氨酸內(nèi)酯酶基因（其編碼產(chǎn)物降解軟腐病原菌的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的信號分子，抑制該系統(tǒng)調(diào)控的致病相關(guān)基因的表達）轉(zhuǎn)入魔芋基因組，為研究該基因是否能夠增加魔芋的抗病性奠定基礎(chǔ)。 本研究以花魔芋愈傷組織繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)細菌污染的愈傷組織為材料，分離花魔芋的內(nèi)生菌，并從中篩選到能抑制軟腐病原菌生長、產(chǎn)芽胞的桿狀細菌BSn5。BSn5的16S rDNA與不同的枯草芽胞桿菌16S rD

3、NA同源性較高，相似性最高為99．2％。BSn5和軟腐病原菌同時接種的馬鈴薯切片無明顯軟腐癥狀，表明該菌能夠削弱軟腐病菌的致病力，具有作為生防菌劑的潛力。硫酸銨鹽析法提取其胞外蛋白，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或透析袋電泳純化蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白，提純蛋白只含有一個31.6kD的蛋白。提純蛋白具有抗菌活性，表明BSn5的抗菌活性物質(zhì)為一種分子量為31.6kD的蛋白質(zhì)，命名為APn5。蛋白質(zhì)性質(zhì)分析結(jié)果表明APn5對熱不穩(wěn)定

4、，對蛋白酶K敏感，對胰蛋白酶不敏感。該蛋白與目前所知的枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的性質(zhì)均不同，是一種新的芽胞桿菌抗菌蛋白。 利用蛋白質(zhì)末端測序獲得APn5的N端15個氨基酸殘基的序列，與芽胞桿菌鞭毛蛋白N端序列同源性達到100％。根據(jù)枯草芽胞桿菌168的鞭毛蛋白的核苷酸序列設(shè)計PCR擴增引物，從BSn5基因組中克隆到855bp的開放閱讀框（ORF）。該ORF裝載入大腸桿菌表達載體pGEX-6P-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得的重

5、組菌能夠抑制軟腐病原菌的生長，表明此855bp序列攜有抗菌活性物質(zhì)的遺傳信息。翻譯核苷酸序列為氨基酸序列，計算得出該蛋白的分子量為30.2kD，與APn5的分子量相近。 此外，以花魔芋塊莖為材料，研究了花魔芋愈傷組織的培養(yǎng)基、篩選劑和篩選時間等因素對轉(zhuǎn)化效率的影響，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花魔芋遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過兩次轉(zhuǎn)化，分別從300個花魔芋愈傷組織中得到了16個和18個具有潮霉素抗性的愈傷組織，其抗性愈傷率為5．33％和6．00％。