紅花中黃酮類化合物抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的實驗研究

1、長春師范大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計）1第一章第一章前言1.11.1紅花簡介紅花簡介紅花(CarthamustinctiusL)為菊科植物，紅花屬紅花的干燥花，生長周期為1~2年，在國際上，印度、美國、埃塞俄比亞、澳大利亞等地為紅花主要種植地，在我國則主產(chǎn)于河南、云南、浙江等地，由于其在種植方面有較好的抗旱、耐鹽堿、抗寒、用途廣泛等諸多優(yōu)點，在我國栽培種植已經(jīng)有兩千多年的歷史[13]在歷史上，紅花被賦予了多種意義，不僅可以用來藥用，還可用于食

2、用、染料和油料等。雖然紅花成分較為復(fù)雜，但已被分離鑒定的化學(xué)成分有60多種，主要分為黃酮類、木脂素類、多炔類等幾大類，而且存在著200多種色素類成分，其中含有豐富的黃色素和紅色素，這是一種純天然染色劑。其他類型的黃酮類物質(zhì)，主要有山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercertin）為基本母核的一系列衍生物及蘆丁（Rutin），楊梅素（Myricetin），芹黃素（Apigenin），木樨草素（Luteoline）等。研究表明紅

3、花有效成分主要為紅花黃色素，是一組水溶性查爾酮類成分，紅花中查爾酮類化合物多為色素類成分，而其中最重要的就是紅花黃色素（saffloweryellow，SY）。SY由紅花黃色素A（HSYA）和紅花黃色素B(SYB)及其衍生物組成，羥基紅花黃色素（HydroxylsaffloweryellowA，HSYA）的研究是最為廣泛的，日本學(xué)者龜高德平首先從我國河南承德紅花干花中分得紅色素（含0.3%～0.6%），它是紅花中含量最高的成分[47]。

4、紅花黃色素有改善心肌及腦組織微循環(huán)障礙的作用[8]，亦有擴張冠脈，抗氧化，保護心肌，降血壓，免疫抑制和腦保護的多種藥理學(xué)功效[9]。1.21.2基質(zhì)金屬蛋白酶（基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）簡介）簡介ECM（extracellularmatrixc）是一種存在于細胞間隙中的大分子物質(zhì)，其臨床方面對于研究腫瘤轉(zhuǎn)移有著極其重要的意義，應(yīng)用蛋白酶降解ECM是治療多種疾病的有效方法，如強直性脊柱炎，心腦血管疾病，腫瘤，糖尿病，炎癥等[1012]?；?/p>

5、質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是一類與Ca2，Zn2金屬離子結(jié)合，可對ECM有極強降解作用的超酶家族，據(jù)現(xiàn)階段研究表明MMPs已鑒定出28種，其又可以分為5大類，分別為①膠原酶、②明膠酶、③基質(zhì)裂解酶、④膜型金屬蛋白酶、⑤其它型。這里，膠原酶主要包含MMP1、MMP8、MMP13，明膠酶主要包含MMP2、MMP9，基質(zhì)裂解酶主要包含MMP3、MMP10、MMP11，膜型金屬蛋白酶主要包含MMP

6、14，MMP15，MMP16、MMP17、MMP24、和MMP25。酶本身的活性點各不相同，這種不同主要是由于染色體序列不同所導(dǎo)致，由此各蛋白酶對應(yīng)的底物與抑制劑也各有不同。根據(jù)報道，MMPs活性的抑制對腫瘤細胞的行為有重要的影響，長春師范大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計）3第二章第二章實驗部分實驗部分2.12.1實驗材料、試劑實驗材料、試劑紅花藥材購買于北京同仁堂大藥房（長春汽車廠分店）。羥基紅花黃色素A（Hydroxylsafflowerye

7、llowA，HSYA）標準物質(zhì)購于中國藥品檢驗所（北京）、紅花黃色素B（AnhydrosafflyellowB，SYB）標準品為實驗室自主分離（純度達98%）。HEPES（Promega），基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2，SinoBilogical），GM6001（ENZQ），0.05%Brij35（SANTA），熒光底物DQ（TM）GELTINFROMPIG（Life），無菌水，DMSO等。2.22.2儀器設(shè)備儀器設(shè)備96孔酶標板（鼎國）

8、，ThermoScientificVarioskanFlash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（Beckman），恒溫培養(yǎng)箱（德國）。2.32.3樣品樣品制備制備自制HEPES緩沖溶液（pH7.0），其成分為50mMHEPES、0.2MNaCl、10mMCaCl2、20MZnSO4及0.05%Brij35。精密稱取適量廣譜MMP的抑制藥物GM6001，用DMSO溶解，配置成15nmolLGM6001溶液待用，于20℃下保存。精密稱取適量熒光底物

9、DQgelatin，用HEPES緩沖溶液溶解，配置成每50?L緩沖溶液中含有0.2?g的DQgelatin溶液待用，于20℃下保存。稱取100g紅花藥材粉末（過40目篩），75%乙醇室溫下浸泡提取6次，每次提取12小時，將75%乙醇提取液過濾合并，減壓濃縮得水液。水液部分用石油醚脫脂2次，棄去石油醚溶液，再用乙酸乙酯溶液萃取5次，棄去乙酸乙酯溶液，水溶液減壓回收蒸干，得到紅花水提取物。稱取適量的紅花水層提取物，超純水溶解過0.45?m濾