中藥血清藥理學(xué)及其在腫瘤藥理中的應(yīng)用

1、1,中藥血清藥理學(xué),在腫瘤藥理中的應(yīng)用,及其,2,,1概說2血清供體動物的選擇3動物給藥及采血方案的設(shè)計4血清的滅活5血清的添加,6含藥血清的保存7實驗研究舉例 8血清藥理學(xué)研究中存在的問題9血清藥理學(xué)工作的發(fā)展趨勢,3,1概說,中藥血清藥理實驗方法是一種新的改良的中藥體外實驗方法。它將受試物（試驗樣品）經(jīng)口給與動物后，取其血清作為藥物源加入離體實驗體系中研究其藥理作用。,4,關(guān)于血清藥理學(xué)的幾篇重要的文獻：,[Iwama

2、 H，Effcet of Shosaikoto（復(fù)方小柴胡湯），a Japanese and Chinese Triditional herbal medicinal mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide，A new pharmacology testing method， J Ethnopharmacol，1987，211：45]，[田代真一，“血清藥理學(xué)”

3、と“血清藥化學(xué)”——漢方の藥理學(xué)から始まつた藥物血中濃度測定の新しい世界，TDM研究，1988，（5）：54][張群豪、陳可冀：血清藥理學(xué)在中藥及復(fù)方研究中應(yīng)用的評價，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（3）：131 [張群豪、鐘蓓、陳可冀，等：用血清藥理學(xué)方法觀察血府逐瘀濃縮丸對實驗性動脈粥樣硬化家兔主動脈平滑肌細胞增殖的影響，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（3）：156,5,中藥血清藥理學(xué)實驗操作基本過程：,,,,,分離血清

4、（滅活？）,保存（條件？時間？）,,6,2血清供體動物的選擇,2.1動物的種屬實驗證實動物血清具有細胞毒作用，體外細胞實驗顯示，這種細胞毒性作用似與種屬親緣有關(guān)，與實驗體系中細胞親緣關(guān)系最接近的動物血清細胞毒性作用最輕，而親緣關(guān)系較遠的動物血清，較高濃度時就會影響細胞的生存。,7,附表1 異種血清的細胞毒作用,與10%小牛血清組比較，a p＜0.05， b p＜0.01。細胞毒性大小排隊（由小到大）：大鼠＜家兔＜豚鼠≈犬＜小牛

5、＜人。,8,上述實驗動物在生物分類中的位置：,哺乳綱（Mamalia）真獸亞綱（Eutheria）嚙齒目（Rodentia）： 鼠科（Muridae） 小鼠：小鼠屬（Mus）小家鼠（M.musculus）變種（M.n.albula）大鼠：大鼠屬（Rattus）褐家鼠（R.norregicus）變種（R.n.albus） 豚鼠科（Caviidae） 豚鼠：豚鼠屬（Cavia）豚鼠（C. porcellus）兔

6、形目（Lagomorpha）（最初分類歸于嚙齒目） 兔科（Lepus） 家兔：真兔屬（Oryctolagus）兔（O. cuniculus）,9,上述實驗動物在生物分類中的位置：,食肉目（Carnivora） 犬科（Canidae）犬：犬屬（Canis）家犬（C. familiaris）偶蹄目（Artiodactyla） 牛科（Bovidae）牛：牛屬（Bos）黃牛（Bos Taurus domesticu

7、s Gmelin） 水牛屬（Bubalus）水牛（Bubalus bubalis Linnaeus）靈長目（Primates） 人科（Hominidae）人：人屬（Homo）智人（H. sapiens）中藥腫瘤血清藥理學(xué)研究中所用動物主要為小鼠、大鼠以及家兔,10,2血清供體動物的選擇,2.2動物的狀態(tài)依據(jù)實驗的具體情況供體動物可以選擇生理狀態(tài)下的動物，也可以選擇病理狀態(tài)（疾病模型）下的動物。中藥腫瘤血清藥

8、理學(xué)研究中所用血清供體動物，主要選擇正常生理狀態(tài)下的動物，但亦有選擇荷瘤動物作為供體動物的。,11,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,3.1給藥劑量與次數(shù)A已知臨床用藥劑量給藥劑量=臨床人用劑量×動物等效劑量系數(shù)×在體外實驗體系內(nèi)的稀釋度。B已知動物藥效學(xué)實驗的有效劑量給藥劑量=動物藥效學(xué)實驗有效劑量×動物等效劑量換算系數(shù)（更換動物時）×在體外實驗體系內(nèi)的稀釋度。,12,3動物給藥及采血方案的設(shè)

9、計,例如某中藥臨床人用劑量為10g/日，體重按50kg計算，則臨床人用為0.2g/kg；血清供體動物選擇大鼠，其等效劑量系數(shù)粗略的按照5來計算，在體外實驗體系中添加含藥血清的量按照20%進行（稀釋倍數(shù)為5），代入上式計算得到：供體動物給藥劑量=0.2×5×5=5g/kg,13,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,3.2給藥次數(shù)在大多數(shù)情況下，多次給藥優(yōu)于單次給藥。多次給藥優(yōu)于單次給藥具有一定的理論依據(jù)，它的理論取決于以

10、下兩個因素：其一、是藥物有無蓄積作用，文獻資料表明，大多數(shù)藥物具有一定的蓄積性的；其二、是多次給藥后，是否會在藥物的作用下機體產(chǎn)生自體活性物質(zhì)，比如激素或免疫活性物質(zhì)，以及這些活性物質(zhì)在該藥效學(xué)實驗中作用的大小。,14,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,給藥次數(shù)大多為每日1次，連續(xù)3至7天，但也可以參照血清藥理學(xué)實驗通法，每日給藥2次（間隔12小時），連續(xù)給藥3天。另外，需要注意的是為了便于藥物吸收，有人主張采血前的最后一次給藥動物應(yīng)予

11、以禁食，禁食時間一般認為以12 ~ 16小時為宜。,15,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,3.3采血時間與方法3.3.1采血時間的確定在實際操作中，采血時間大多在給藥后1至2小時，也有縮短至0.5小時或延長至4小時的。3.3.2采血要求：①采血必須在嚴格無菌的條件下進行。②如果采用麻醉的話，建議采用乙醚吸入麻醉。③靜置2小時以上，保證血液徹底凝固，得到真正的“血清”。④離心（3000rpm）10至15分鐘，得到含藥血清。⑤必要時，可以

12、用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。,16,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,3.4關(guān)于中藥血清藥理學(xué)實驗通法資料：文獻載有口服給藥Tmax（血藥高峰時間）的藥物113個，文獻載有T1/2（半衰期）的藥物412個?；A(chǔ)理論依據(jù)：（1）藥物多次給藥后，經(jīng)過4~5個T1/2達到坪值，此后停止給藥，按一級動力學(xué)清除的藥物也要經(jīng)過4~5個T1/2在體內(nèi)基本消除，對少數(shù)按照零級動力學(xué)（按每單位時間消除恒定藥量使血漿濃度逐漸下降）消除的藥物則需要更長時間

13、。（2）在一次給藥后，藥物尚未達到完全消除而接受第二次給藥，血藥濃度可因蓄積而積累。,17,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,采血時間點確定：將已知口服給藥Tmax數(shù)據(jù)的113個藥物進行頻譜分析如下：附表3-1 Tmax的分布范圍是15min ~ 24h，符合正態(tài)分布，排列數(shù)據(jù)時0.5 ~ 1h按0.5h計算，1 ~ 2h按1h計算。Tmax在1h的有49個藥物，占43.4%（49/113），若加上30min ~1h的10個藥，則比

14、例高達52.2%（59/113），也就是說，口服藥物后1h血中藥物達到高峰濃度（Cmax）的機會（概率）是52.2%。,18,藥物蓄積性分析：依據(jù)藥動學(xué)理論，一種藥物能否蓄積，取決于該藥T1/2的長短和服藥時間間隔。如果藥物尚未完全消除而第二次給藥，即可產(chǎn)生蓄積。412個已知T1/2的藥品頻譜分析如下：,附表3-2,T1/2分布范圍是12min ~ 150h，符合正態(tài)分布，T1/2＞3h的藥物有216個，占67%（216/412）。若每

15、日給藥2次，間隔12h，那么T1/2＞3h的藥物均可產(chǎn)生蓄積。,19,3動物給藥及采血方案的設(shè)計,依據(jù)上述推論得到實驗通法。通法規(guī)定，口服給藥，每日2次，間隔12h，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h采血，總體而言中藥成分中約67%可能具有蓄積作用，再加上無蓄積性但在其口服后1h在Tmax內(nèi)的68個藥品，占412個藥品中的16.5%，兩者相加可達83.5%。,20,附表3-3 例：一項關(guān)于含藥血清藥理作用強度與體內(nèi)給藥的量效、時效關(guān)系研究

16、的結(jié)果,注：與空白血清組比較，a p＜0.05， b p＜0.001。 n（每組復(fù)空數(shù)）=8，含藥血清加入量10%。實驗方法：大鼠灌胃給以待測樣品，劑量為45、90、180、360mg/kg，1/d，5d，末次給藥后30、60、90、120分鐘采血，制備含藥血清，作用于缺氧復(fù)氧損傷的乳鼠心肌細胞，通過測定LDH釋放量及其抑制率來評價藥物血清對心肌損傷的保護作用。,21,4血清的滅活,4.1血清滅活的原因與目的附表4-1滅活與非滅活

17、正常（空白）血清對細胞生長的影響 與非滅活血清比較a p＜0.05， b p＜0.01血清來源：大鼠；細胞系：小鼠3T3細胞株。,22,4血清的滅活,附表4-2滅活與否對含藥血清生物活性的影響（一）某藥物含藥血清對病毒致細胞病變作用的影響 血清來源：家兔細胞系：Hep-2人喉癌細胞株病毒：副流感病毒-Ⅱ型,23,附表4-3,滅活與否對含藥血清生物活性的影響（二）某藥物含藥血清對小鼠離體子

18、宮收縮的影響,空白血清各組均與未處理組比較 a p＜0.05， b p＜0.01采用同一處理方法空白血清組與含藥血清組比較 ▲p＜0.01。血清來源： 小鼠,24,4血清的滅活,4.2血清滅活的方法①加熱滅活法：加熱56℃，維持30分鐘。（最常用的方法）②丙酮滅活法：在血清中加入4至5倍量的丙酮，混勻，3000rpm離心，取上清液水浴，揮干丙酮即可。③乙醇滅活法：處置方法同丙酮滅活法。將丙酮更換成乙醇即可。,25,5血清

19、的添加,決定藥物血清添加量多少主要取決于以下兩點：①血清本身具有生物活性，其中包括細胞毒活性。②中藥成分的復(fù)雜性決定了藥血清藥理學(xué)量效關(guān)系往往不明確。,26,附表5 不同血清添加量對細胞（3T3）生長的影響,另外，含藥血清也可以制備成凍干粉直接加入實驗體系中。對于抗腫瘤中藥血清藥理學(xué)實驗而言，含藥血清的添加量一般多為10% ~ 20%。,27,6含藥血清的保存,在4℃環(huán)境下，一般不宜超過5天，低溫條件下，可以適當(dāng)延長保存時間。,

20、28,7實驗研究舉例,29,例1,【樣 品】中藥腸安泰（組方：大黃 藤梨根 薏苡仁 木香等8味）【研究目的】觀察腸安泰及其主要成分藥物（大黃、藤梨根）的含藥血清對腫瘤細胞的殺傷能力?！灸[瘤細胞】Co26lu大腸癌細胞株【動 物】Wistar大鼠，♀，300±10g。,30,例1,【給藥方案】腸安泰（干膏）、大黃（干膏）、藤梨根（干膏），ig，0.6ml·kg-1·d-1。劑量分別為腸

21、安泰0.8g·kg-1（相當(dāng)于人用劑量的8倍），大黃0.8g·kg-1，藤梨根0.8g·kg-1。兩種方案， 一日給藥和三日給藥，前者給藥一次，1小時后采血，后者連續(xù)給藥三日，每日一次，末次給藥后1小時采血。給藥前均禁食6 ~ 12小時。,31,例1,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?【試驗體系】腫瘤細胞1×106個/ml，加入96孔板，90μl/孔?！狙寮恿俊?0%、3

22、0%、50%?！驹u價方法】MTT法,32,例1,【評價指標】OD值、腫瘤生長抑制率。 【實驗過程】動物給藥， 采血， 分離血清， 加入試驗體系， 37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時， 加入MTT，4小時， 比色， 測定OD值， 計算腫瘤生長抑制率。【實驗結(jié)果】詳見附表,33,例1實驗結(jié)果附表,與模型組相比，※P＜0.05，※※P＜0.01。,34,例1,【實驗結(jié)論】腸安泰具有抑制腫瘤細胞增殖的活性，并呈劑量依賴性，且復(fù)方的抗腫瘤活性優(yōu)

23、于單味藥。王文萍，等：中藥腸安泰體外對Co26lu大腸癌細胞的血清藥理學(xué)研究，中華中醫(yī)藥研究，2006，21（4）：213,35,例2,【樣 品】參葵湯（苦參 龍葵 山慈菇 墓頭回 莪術(shù) 黃芪 女貞子 當(dāng)歸 甘草等12味）【研究目的】研究參葵湯對卵巢癌細胞增殖的影響【腫瘤細胞】Tyk-nu卵巢癌細胞株，人新鮮的卵巢癌組織分離細胞?！緞?物】SD大鼠，♂，300±10g。,36,例2,【給藥方

24、案】灌胃給藥，3.27、6.54、13.08g / 300g（等于10.9、21.8、43.6g / kg，相當(dāng)于臨床人用的等效劑量、2及4倍等效劑量），每日1次， 連續(xù)10日， 末次給藥后1小時采血 【血清處置】56℃，30分鐘滅活。,37,例2,【實驗體系】腫瘤細胞5×105個/ml，加入96孔板，190μl/孔，3復(fù)孔?！狙寮恿俊?0%，配置培養(yǎng)基時加入。【評價方法】3H-TdR摻入法、流式細胞術(shù)、胎盤蘭染色計數(shù)

25、、細胞集落形成?！驹u價指標】同位素放射脈沖量（cpm）、細胞增殖指數(shù)（PI）、細胞活力、集落形成率、,38,例2,【實驗過程】動物給藥， 采血， 分離血清， 加入培養(yǎng)基中，分離腫瘤組織，制備新鮮及傳代培養(yǎng)的腫瘤細胞的懸液，37℃，5%CO2，100%濕度，分別培養(yǎng)60、72、48、72小時供cpm、PI、細胞活力、集落形成率等測定?！緦嶒灲Y(jié)果】詳見附表,39,例2實驗結(jié)果附表,（一）含藥血清對新鮮卵巢癌腫瘤組織細胞增殖的影響,※與空

26、白血清組比較P＜0.01；＃與低濃度含藥血清組比較P＜0.01；○與中濃度含藥血清組比較P＜0.05。,40,（二）藥血清對Tyk-nu卵巢癌細胞增殖的影響,與空白血清組比較※P＜0.05；與低濃度含藥血清組比較＃ P＜0.01；與中濃度含藥血清組比較○ P＜0.05 P＜0.05,41,例2,【實驗結(jié)論】含參葵湯大鼠血清可抑制卵巢癌新鮮實體瘤細胞及卵巢癌細胞株Tyk-nu細胞增殖。 張軍，等：參葵湯對卵巢癌患者新鮮實體瘤細胞

27、及細胞株Tyk-nu細胞增殖的影響，中醫(yī)雜志， 2005，46（3）：219,42,例3,【樣 品】三物白散加味方（含10%油的巴豆霜 貝母 桔梗 地鱉蟲 莪術(shù) 參三七 生薏苡仁 全蝎 木香 炒白芍藥 甘草等）（注：三物白散方 自《傷寒論》【研究目的】在臨床治療胃癌有效的基礎(chǔ)上， 觀察藥物對胃癌細胞腫瘤相關(guān)基因表達的影響【腫瘤細胞】胃癌SGC-7901細胞株。【動 物】日本大耳白，2.5±

28、0.2kg，♀/♂，每劑量組2只。,43,例3,【給藥方案】灌胃給藥，0.21、0.63、2.1g/只，1次/日，連續(xù)3日，末次給藥后2小時， 心臟采血， 分離血清。 【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存。 【實驗體系】腫瘤細胞數(shù)量無記載?！狙寮恿俊?00%。 （？）【評價方法】單抗試劑盒， 流式細胞術(shù)【評價指標】多藥耐藥基因MDR,44,例3,【實驗過程】胃癌SGC-7901細胞株傳

29、代培養(yǎng)， 胰酶消化，分瓶，待細胞貼壁后加入三個劑量組的血清，作用10小時， 免疫標記，流式細胞儀測試?！緦嶒灲Y(jié)果】三物白散加味方含藥血清對胃癌腫瘤細胞多藥耐藥基因表達具有抑制作用，并呈量效關(guān)系。,45,三物白散加味方對MDR基因表達率的影響,※※與陰性對照組相比P＜0.01。,例3實驗結(jié)果附表,46,例3,【實驗結(jié)論】三物白散加味方對胃癌腫瘤細胞多藥耐藥基因表達有抑制作用。[徐力，等：三物白散加味方影響多藥耐藥基因表達實驗研究，上海

30、中醫(yī)藥雜志，2005，39（8）：59],47,例4,【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】評價黃連解毒湯的抗腫瘤活性。【腫瘤細胞】結(jié)腸癌Swille、肺腺癌SPC-A-1、胃癌SGC-7901、乳腺癌MCF-7細胞株?！緞?物】荷瘤（H22肝癌）小鼠，昆明種，18 ~ 22g，♀，每組11 ~ 12只。,48,例4,【給藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯49.5、16.5、5.5g/kg（相

31、當(dāng)于臨床人用劑量的9、3、1倍），1次/日，連續(xù)8日，末次給藥后1小時摘眼球取血，分離并合并動物血清。同期給以陽性對照藥環(huán)磷酰胺，25mg/kg?！狙逄幹谩浚ú粶缁睿?，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存?！緦嶒烍w系】4種腫瘤細胞配置濃度均為1×105個/ ml，接種于96孔板，每孔100μl，每組10復(fù)孔?！狙寮恿俊?0%?！驹u價方法】MTT法?！驹u價指標】細胞生長抑制率。,49,例4,【實驗過程】動物接種

32、腫瘤細胞，分組，給藥，給藥結(jié)束，采血，分離合并血清，結(jié)腸癌Swille等腫瘤細胞體系中加入含藥血清，培養(yǎng)72小時，加入MTT，培養(yǎng)4小時，比色， 測定吸光度，計算細胞生長抑制率。 【實驗結(jié)果】詳見附表。黃連解毒湯對H22小鼠肝癌實體瘤有一定的體內(nèi)抗腫瘤活性，并具劑量依賴性；其含藥血清體外對4種人的腫瘤細胞也有一定的抑制作用?！緦嶒灲Y(jié)論】黃連解毒湯體內(nèi)、體外均有抗腫瘤活性，結(jié)果具有一致性且呈明確的量效關(guān)系。[孫健，等：黃連解毒湯抗腫

33、瘤作用的實驗研究，中國中藥雜志，2006，31（17）：1461],50,例4實驗結(jié)果附表黃連解毒湯20%含藥血清體內(nèi)、外腫瘤抑制作用,與對照組相比， 2）P＜0.01，3）P＜0.001。,51,例5,【樣 品】黃連解毒湯（黃連 黃芩 黃柏 梔子組成）【研究目的】對比黃連解毒湯及其含藥血清的抗腫瘤作用，進行化學(xué)成分分析。【腫瘤細胞】肺癌NCI-H446、肝癌Bel-7402細胞株?！緞?物】Wistar大鼠

34、，♂，250 ~ 300g，8只/組?！窘o藥方案】灌胃給藥， 黃連解毒湯21、10.5、5.25g/kg，2次/日，連續(xù)3日，末次給藥（灌藥前禁食16小時）后2小時，乙醚麻醉，腹主動脈采血，無菌分離血清，同組血清合并?！狙逄幹谩?6℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌， -20℃保存。,52,例5,【實驗體系】兩種細胞懸液濃度均為2.5×104個/ml，接種于96孔板，每孔100μl，每組6復(fù)孔?！狙寮恿俊?/p>

35、20%。【評價方法】MTT法?！驹u價指標】細胞生長抑制率?！緦嶒炦^程】在觀察黃連解毒湯含藥血清對腫瘤細胞作用的同時， 同步觀察黃連解毒湯樣品對腫瘤細胞生長的影響。 采用 HPLC梯度洗脫對比分析了黃連解毒湯及其含藥血清化學(xué)成分的異同。,53,例5,【實驗結(jié)果】黃連解毒湯及其含藥血清對腫瘤細胞生長的影響詳見附表。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們對2株腫瘤細胞的生長均有抑制作用，HPLC檢測結(jié)果顯示， 黃連解毒湯含藥血清與空白血清對比發(fā)現(xiàn)，口服黃連解毒

36、湯的吸收入學(xué)的成分較多，經(jīng)過黃連解毒湯樣品與其含藥血清進行對比分析，初步確定了10個來源于復(fù)方的原型成分，同時還有幾個代謝產(chǎn)物，但原方劑中的主要成分并未在血清中檢測到。,54,例5實驗結(jié)果附表黃連解毒湯的腫瘤生長抑制作用,與0劑量組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01，3）P＜0.001,55,20%黃連解毒湯含藥血清的腫瘤生長抑制作用,與空白血清組比較：1）P＜0.01，2）P＜0.001。,56,例5,【實驗結(jié)論】黃連解毒湯及

37、其含藥血清對2種瘤株抑制程度變化的原因可能是黃連解毒湯中各主要成分吸收入血后含量變化造成的。對其進行深入研究，將有助于闡明黃連解毒湯抗腫瘤的有效成分及作用機制。[孫健，等：黃連解毒湯及其含藥血清的化學(xué)成分及抗腫瘤作用對比研究，中國中藥雜志，2006，31（18）：1526],57,例6,【樣 品】復(fù)方斑蝥膠囊（國藥準字Z19993409）。【研究目的】考察該藥含藥血清對肝癌腫瘤細胞蛋白質(zhì)組的影響，從分子水平探討其抗腫瘤的作用機

38、制?！灸[瘤細胞】肝癌SMMC-7721細胞株?！緞?物】新西蘭大耳白兔，2.5±0.2kg，♀/♂兼用。,58,例6,【給藥方案】按下述公式計算動物給藥劑量：動物給藥劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)×培養(yǎng)體系血清稀釋度式中：等效劑量系數(shù)（按體表面積計算）=S兔/S人lgS = 0.8762 + 0.698 lgW（動物 體表面積和體重之間的關(guān)系式）S = 體表面積（cm2）W = 體重（g）

39、計算得到家兔給藥劑量為3倍臨床等效劑量。以PBS將復(fù)方斑蝥膠囊配置成混懸液，連續(xù)灌胃3日，末次給藥后3小時心臟采血，收集血清，同組血清合并。,59,例6,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔過濾除菌， -20℃保存。【實驗體系】（略）【血清加量】10%。【評價方法】雙向電泳，圖像分析，質(zhì)譜鑒定?！驹u價指標】含藥血清作用后差異蛋白的表達情況及質(zhì)譜鑒定?！緦嶒炦^程】含藥血清作用于腫瘤細胞72小時，分離，清洗，收集細

40、胞；細胞裂解，提取蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)雙向電泳，染色，圖像分析，選取具有2倍以上量變的蛋白質(zhì)（差異蛋白質(zhì)）；質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定蛋白質(zhì)點。,60,例6,【實驗結(jié)果】結(jié)果詳見附表?！緦嶒灲Y(jié)論】發(fā)現(xiàn)4種與腫瘤的增殖、免疫、凋亡相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，為進一步研究藥物作用機制提供了線索。血清藥理學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合能夠有效的展示與藥物作用相關(guān)蛋白質(zhì)，可以作為研究復(fù)方藥理的一個初步技術(shù)平臺。[曹永艷，等：復(fù)方斑蝥膠囊血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7

41、721細胞蛋白質(zhì)組差異表達分析，中國中藥雜志，2007，32（9）：831],61,例6實驗結(jié)果附表質(zhì)譜鑒定的差異表達蛋白質(zhì)點,真核翻譯起始因子5A（eIF-5A）：表達下調(diào)?？鼓[瘤作用的重要靶標，在低分化、12/13密碼子K-ras突變、p53核蓄積的腫瘤中高表達。膜聯(lián)蛋白A5（Annexin Ⅴ）：表達上調(diào)。一種抗腫瘤增殖的蛋白質(zhì)。熱休克70×103蛋白（HSP70）：表達上調(diào)。與腫瘤細胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)。硫氧還蛋

42、白過氧化酶（PRDX2）2：表達下調(diào)。一種作用于Bcl-2上游的抗凋亡蛋白。,62,例7,【樣 品】多羅清泰顆粒（女貞子 黃芪 靈芝 蒲公英 紅景天 藏紅花 半支蓮 蛇舌草 茯苓 葛根等組成）【研究目的】在證實多羅清泰顆粒體內(nèi)實驗對小鼠肝癌有抑制作用的基礎(chǔ)上，以血清藥理學(xué)方法和基因芯片技術(shù)觀察藥物對人肝癌細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達的影響?！灸[瘤細胞】肝癌SMMC-7721細胞株?！緞?物】SD大鼠，300&

43、#177;30g，♂，30只，隨機分為3組?！窘o藥方案】灌胃給藥，8、16g/kg（相當(dāng)于生物等效劑量的4倍和8倍），1次/日，連續(xù)10日，末次給藥前禁食12小時，給藥后1小時摘眼球取血，無菌分離血清。,63,例7,【血清處置】56℃，30分鐘滅活，0.22μm微孔濾膜過濾除菌， -20℃保存?！緦嶒烍w系】肝癌SMMC-7721細胞株常規(guī)培養(yǎng)。【血清加量】10%?！驹u價方法】基因芯片技術(shù)?！驹u價指標】基因轉(zhuǎn)錄相對豐度分析?！?/p>

44、實驗過程】含藥血清與腫瘤細胞共同培育48小時， 收集，清洗，裂解細胞；提取并鑒定DNA，制備探針，雜交，化學(xué)發(fā)光檢測，數(shù)據(jù)分析；RT-PCR驗證基因芯片檢測結(jié)果。,64,例7,【實驗結(jié)果】多羅清泰顆粒含藥血清對所檢測的99條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因中的68條基因表達具有顯著影響，占所測基因的69%，其中，上調(diào)基因為36條，下調(diào)基因為36條，不同劑量組之間的基因表達存在相當(dāng)大的差異?！緦嶒灲Y(jié)論】多羅清泰顆粒能顯著抑制肝癌細胞的生長，能顯著影響肝癌細

45、胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達。[謝佐福，等：多羅清泰顆粒對人肝癌細胞株信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達的影響，中草藥，2007，38（5）：720],65,例8,【樣 品】半夏瀉心方全方（半夏 干姜 黃芩 黃連 人參 大棗 甘草組成）以及6個不同的配伍方（辛開 苦降 辛苦 甘補 辛甘 苦甘組方）?！狙芯磕康摹垦芯堪胂臑a心方全方及不同配伍方含藥血清對胃癌細胞凋亡的影響及作用機制?！灸[瘤細胞】胃癌BGC-823細胞株【動

46、物】家兔，2.0 ~ 2.5kg，2只/組?！窘o藥方案】全方及6種配伍方給藥劑量分別為52、20.8、10.4、31.2、20.8、39、31.2g/kg（相當(dāng)于臨床人用劑量的10倍）。 連續(xù)灌胃3次， 第1、2次間隔20小時， 第2、3次間隔4小時，實驗前禁食12小時。末次給藥后2小時無菌條件下心臟采血， 分離血清。,66,例8,【血清處置】56℃，30分鐘滅活， -20℃保存。經(jīng)培養(yǎng)證實沒有微生物生長?！緦嶒烍w系】傳代培養(yǎng)胃癌B

47、GC-823細胞，以培養(yǎng)液懸浮成細胞懸液，接種于96孔板，每孔1×104個細胞，每濃度設(shè)3個復(fù)孔?！狙寮恿俊?%和10%。【評價方法】MTT法（細胞毒作用評價）、DNA凝膠電泳（細胞凋亡檢測）、S-P免疫組化法（Bcl-2基因表達）?！驹u價指標】細胞存活率，DNA“梯狀帶”顯示，基因表達陽性細胞率。,67,例8,【實驗過程】①將含藥血清加入到對數(shù)生長期的腫瘤細胞實驗體系中，分別培育24、48、72小時，爾后，以MTT法

48、測定吸光度，計算細胞存活率。②取以含藥血清作用48小時的腫瘤細胞進行DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳。③將細胞濃度為2×104個/ml的細胞懸液加入到直徑為5厘米的培養(yǎng)皿中，并在皿中放置小塊玻片先培養(yǎng)24小時，加入含藥血清，孵育48小時，取出玻片，清洗，固定，干燥，免疫組化染色。,68,例8,【實驗結(jié)果】樣品全方及不同配伍方對細胞生長的影響結(jié)果詳見附表。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，全方、甘補、辛甘、苦甘組含藥血清在凝膠電泳中未能見

49、到典型的“梯狀帶”。辛苦、辛開、苦降組10%含藥血清作用的細胞，其凝膠電泳中可見典型的“梯狀帶”。免疫組化結(jié)果顯示，未經(jīng)處理腫瘤細胞的Bcl-2基因產(chǎn)物高表達，在樣品全方及不同配伍方含藥血清的作用下，Bcl-2的表達受到程度不等的抑制，其中辛苦、辛開、苦降組作用明顯，并以辛苦組作用最佳。,69,例8,【實驗結(jié)論】半夏瀉心方中辛開、苦降的配伍形式具有抑制BGC-823細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡作用，辛開、苦降配伍后（辛苦）有顯著協(xié)同增效趨勢，

50、而其他配伍藥群可能存在拮抗作用。提示辛開苦降法可能是中醫(yī)藥防治胃癌的主要治則治法之一。[劉喜平，等：半夏瀉心方配伍與誘導(dǎo)BGC-823 細胞凋亡關(guān)系血清藥理學(xué)研究，中醫(yī)雜志，2006，47（2）：134],70,例8實驗結(jié)果附表 半夏瀉心方及配伍藥組含藥血清對BGC-823細胞生長的影響,與空白組同項目比較，※P＜0.05，※※P＜0.01；與辛苦組同項目比較，△P＜0.05；與苦降組同項目比較，▲P＜0.05；

51、與辛開組同項目比較，▽P＜0.05。,71,例9,【樣 品】川芎嗪【研究目的】觀察川芎嗪含藥血清對人肝癌細胞Hep G2增殖的影響?！灸[瘤細胞】肝癌Hep G2細胞株?！緞?物】SD大鼠，♂，250 ~ 300g，10只/組。【給藥方案】川芎嗪143.0、71.5mg/kg，腹腔注射，1次/日，連續(xù)7日，末次給藥后0.5小時于無菌條件下經(jīng)股動脈采血，分離血清，同組合并?！狙逄幹谩?.45μm微孔濾膜過濾除菌， 分

52、裝，-20℃保存?！緦嶒烍w系】以1×104個/ml濃度的Hep G2腫瘤細胞懸液接種于96孔板，200μl/孔，每組6復(fù)孔。,72,例9,【血清加量】20%、10%、5%?！驹u價方法】MTT法，RP-HPLC法。【評價指標】腫瘤細胞生長抑制率，含藥血清中川芎嗪的含量。【實驗過程】在經(jīng)過24小時細胞培養(yǎng)的96孔板中加入濃度不等的含藥血清及空白對照血清，孵育48小時， MTT法測定每孔的吸光度，計算細胞生長抑制率。另一部分

53、高劑量組含藥血清將被用來測定川芎嗪的含量?！緦嶒灲Y(jié)果】含藥血清對腫瘤細胞生長抑制作用的結(jié)果詳見附表。川芎嗪含量測定表明，高劑量組大鼠含藥血清中其含量為381.5μg/ml。,73,例9實驗結(jié)果附表川芎嗪含藥血清對人肝癌細胞的抑制作用,與空白組比較：※P＜0.05，與生理鹽水比較：▲P＜0.05。,74,例9,【實驗結(jié)論】川芎嗪含藥血清對人肝癌Hep G2增殖有一定的抑制作用。[豐俊東，等：川芎嗪含藥血清對人肝癌細胞Hep G2增殖

54、的抑制作用，中草藥，2005，36（4）：551],75,例10,【樣 品】剔毒護肝方（黃芪 莪術(shù) 組成）全方及其拆方?！狙芯磕康摹刻接懱薅咀o肝方及其組成藥物黃芪、莪術(shù)、葉下珠對人肝癌細胞增殖及端粒酶活性的影響?！灸[瘤細胞】肝癌Bel-7402細胞珠?！緞?物】SD大鼠，♂，200 ~ 300g，3只/組?！窘o藥方案】剔毒護肝方全方0.3g/kg，黃芪0.09g/kg，莪術(shù)0.09g/kg，葉下珠0.12g/kg

55、分別給不同組別大鼠灌胃給藥，2次/日， 連續(xù)3日，第4天給予全日劑量后1小時，下腔靜脈采血，分離含藥血清，同組動物血清混合。,76,例10,【血清處置】56℃，30分鐘滅活， -70℃保存?！緦嶒烍w系】腫瘤細胞以1×105濃度接種于96孔版中，200μl/孔。每劑量組設(shè)4復(fù)孔?！狙寮恿俊?0%?！驹u價方法】MTT法測定樣品的細胞毒性，PCR-ELISA法測定端粒酶活性?！驹u價指標】腫瘤生長抑制率，端粒酶活性抑制率。

56、【實驗過程】腫瘤細胞培養(yǎng)24小時后更換含藥血清，孵育48小時，加入MTT，測定吸光度，計算腫瘤生長抑制率；收集各組經(jīng)含藥血清處置的腫瘤細胞，按照試劑盒說明書所述方法進行端粒酶活性測定。,77,例10,【實驗結(jié)果】詳見附表。實驗結(jié)果表明，剔毒護肝方全方能抑制人肝癌細胞的增殖和端粒酶活性，有一定的抗肝癌作用，進一步拆方研究發(fā)現(xiàn)，方中莪術(shù)能抑制人肝癌細胞的增殖和端粒酶活性，而葉下珠和黃芪則無此作用。提示剔毒護肝方主要是通過方中莪術(shù)來發(fā)揮其抗癌

57、作用?！緦嶒灲Y(jié)論】剔毒護肝方具有抑制肝癌細胞增殖的作用，其作用機制之一在于抑制腫瘤細胞端粒酶的活性，該方抗腫瘤的藥理作用主要來自于該組方中的莪術(shù)。[蔣小玲，等：剔毒護肝方及其拆方對人肝癌細胞增殖及端粒酶活性的影響，中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2004，14（2）：91],78,例10實驗結(jié)果附表。含藥血清對腫瘤細胞增殖的影響,與對照組比，※P＜0.01。,79,含藥血清對腫瘤細胞端粒酶活性的影響,與腫瘤細胞對照組比較，※P＜0.01。,80

58、,8血清藥理學(xué)研究中存在的問題,（1）實驗動物選擇無法達到理想狀態(tài)（2）含藥血清存在缺陷（3）無法確定最佳給藥方案（4）無法確定最佳采血時間（5）含藥血清是否滅活不統(tǒng)一（6）血清藥理很難做到既保證實驗體系藥物濃度與血藥濃度相等又不影響組織及細胞的生長（7）藥理學(xué)實驗增加了藥物化學(xué)工作的難度,81,9血清藥理學(xué)工作的發(fā)展趨勢,（1）血清藥理學(xué)方法的完善，主要是通過基礎(chǔ)學(xué)研究，對許多不確定的因素進行探索，使得實驗盡可能的規(guī)范化；