酶的種類,活性及影響因素

1、酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究和影響酶的活性,,【摘要】：酶廣泛存在與生物體中，對(duì)生命的生化反應(yīng)至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)主要探究不同濃度下催化活性的不同，以及溫度，pH值，抑制劑對(duì)于酶活性的影響。 【關(guān)鍵詞】：酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH，溫度，抑制劑,【酶的特性綜述】 酶是一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，有單純酶和結(jié)合酶兩種。單純酶只含蛋白質(zhì)，不含其它物質(zhì)，其催化活性僅由蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定。結(jié)合酶則由單純蛋白質(zhì)和輔基組

2、成，輔基是結(jié)合酶催化活性中不可缺少的部分。 (1)酶的催化效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過化學(xué)催化劑(高108～109倍)。(2)酶催化劑具有高效化學(xué)選擇性，能從混合物中選擇特定異構(gòu)體進(jìn)行催化反應(yīng)。(3)酶催化劑對(duì)反應(yīng)條件要求苛刻，如pH值、溫度都各有特定的界限，超出界限即可引起酶蛋白的變性與分解。,酪氨酸酶簡(jiǎn)介,酪氨酸酶是一種多酚氧化酶,具有廣泛用途。它主要存在于動(dòng)植物體中,在它的催化作用下經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)生成色素。缺乏此酶將導(dǎo)致代謝性病變：白

3、化病；相反，如果該酶活力過高，又可形成黑色素瘤，最近人們還研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶可能還與白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制有關(guān)。因此研究酪氨酸酶不僅有理論意義，而且還有一定的應(yīng)用價(jià)值。,實(shí)驗(yàn)原理,酪氨酸是一種以Cu+ 或Cu2+ 為輔助因子的全酶，能催化空氣中的氧對(duì)多巴的氧化反應(yīng)，催化過程可以通過多巴轉(zhuǎn)換反應(yīng)的顏色變化來監(jiān)測(cè)，通過測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化來求的酶的活性。,實(shí)驗(yàn)原理,25℃時(shí)在 1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 mol底物所需要的量為酶的活性單位。通過下式可計(jì)算出所

4、用的酶的活性：a=ΔA*10^-6/ktV式中：a為所用溶液的酶的活性，ΔA為最大吸收處吸光度的變化，t為時(shí)間，k為酪氨酸的摩爾吸收系數(shù)，V為加入的酶體積。進(jìn)而計(jì)算出所用原料中的酶的活性：A=a×V0/m 式中：a為原料中酶的活性，V0為原料所得的酶溶液的總體積（9ml），m為原料總質(zhì)量（10.0g）,實(shí)驗(yàn)試劑與儀器,實(shí)驗(yàn)步驟,酪氨酸酶的提取 在研缽中放入10.0g切碎的馬鈴薯,加入7.5mlpH值7

5、.2的緩沖溶液,研磨擠壓。濾出提取液,離心分離。傾出上層清液保存于冰浴或冰箱中。 酶活性的測(cè)定 取2.5ml上述提取液,用pH值7.2的緩沖溶液于10.0ml比色管中稀釋至刻度,搖勻。取0.1ml稀釋過的提取液于10.0ml比色管中,加入2.9mlpH值6.0的緩沖溶液,再加入2.0ml多巴溶液,用分光光 度計(jì)在480nm處測(cè)定吸光度。開始6min內(nèi)每分鐘讀1個(gè)數(shù),以后隔2min讀1個(gè)數(shù),直至吸光度變化不大為止,得吸光度為A

6、1。取0.2,0.3,0.4ml已稀釋過的提取液重復(fù)上述試驗(yàn),得吸光度分別為A2、A3、A4。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄,表1：不同酶加入量不同時(shí)間反應(yīng)的吸光度測(cè)定,以吸光度值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，可得出在加入酶的作用下多巴的轉(zhuǎn)換動(dòng)力學(xué)過程，再由直線部分得出轉(zhuǎn)換速率，即為酶的活性。為使作圖更為準(zhǔn)確，現(xiàn)只取前六分鐘內(nèi)數(shù)據(jù)作圖如下：,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析,圖1:0.10mol提取液關(guān)系曲線 圖2:0.20mol提取液

7、關(guān)系曲線,圖3:0.30mol提取液關(guān)系曲線 圖4:0.40mol提取液關(guān)系曲線,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所畫圖及求出的活度來看，分別加入0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml的活性是不一樣，按照實(shí)驗(yàn)推測(cè)，應(yīng)該是逐漸上升的，但是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)的情況上來看，并不是如此，而是上升之后下降，原因在于酶提取液提取之后保存方法不得當(dāng)，并沒有冰浴，所以導(dǎo)致酶失活，從而導(dǎo)致活性下降的情況,依次得出不同

8、提取液的活性，比較不同體積的提取液加入后相同量的多巴轉(zhuǎn)換速率。由于放置時(shí)間較長，第四組實(shí)驗(yàn)已經(jīng)失去可靠性。（酪氨酸酶的吸光系數(shù)為lg k=3.7。）表2：酶的活性計(jì)算,酶活性影響因素的研究,取0.40ml稀釋過了的提取液在沸水浴中加熱5min，冷卻后配成測(cè)定溶液，觀察現(xiàn)象。取0.40ml稀釋過的提取液，加入少量的固體Na2S2O3配成測(cè)定溶液，觀察現(xiàn)象。取0.40ml稀釋過的提取液，加少量EDTA振動(dòng)混合，反應(yīng)一段時(shí)間后配成測(cè)定溶

9、液，觀察現(xiàn)象。,數(shù)據(jù)記錄,實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論,（1）在沸水浴中加熱5分鐘冷卻后測(cè)得的溶液吸光度基本保持不變，其酶的活性在高溫下失活。（2）加入少量固體Na2S2O3配成的測(cè)定溶液，其測(cè)得的吸光度也基本保持不變且比（1）條件下的吸光度還小，其原因是硫代硫酸鈉是還原劑， 使蛋白質(zhì)變性。（3）稀釋的提取液加入少量EDTA振動(dòng)混合，其測(cè)得的吸光度在緩慢減小。其原因是EDTA與輔助因子絡(luò)合，使酶活性失活。,影響酶活性的因素,影響酶活性的因素,實(shí)

10、驗(yàn)現(xiàn)象證明，唾液淀粉酶活性有效,實(shí)驗(yàn)一 淀粉酶活性的檢測(cè),影響酶活性的因素,實(shí)驗(yàn)二 pH對(duì)酶活性的影響,1.pH過小（過酸）、過大（過堿）都能使酶蛋白變性而失活.2.pH的改變能影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也可以影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化，只有在特定的pH下，酶、底物和輔酶的解離狀態(tài)，最適宜它們相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶反應(yīng)速度達(dá)到最大值。這個(gè)pH稱為酶的最適pH。唾液淀粉酶的最

11、適PH為中性，故在蒸餾水中沉淀最多，鹽酸酸性過強(qiáng)，使酶的活性失活，乳酸是弱酸，顏色基本不變，碳酸鈉是弱堿，產(chǎn)生較少的沉淀。,酶活性的影響因素,實(shí)驗(yàn)三 溫度對(duì)酶活性的影響,酶的催化作用受溫度的影響很大，酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以溫度過高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶的失活，唾液淀粉酶在70°和0°時(shí)，酶活性失活，顏色呈藍(lán)色。在37°時(shí)，是唾液淀粉酶的最適溫度，淀粉遇唾液淀粉酶水解，顏色呈淺黃色。,影響酶活性的因素,實(shí)

12、驗(yàn)四 抑制劑與激活劑對(duì)酶活性的影響,酶的活性受某些物質(zhì)的影響，能使酶活性增加的稱為激活劑，能使酶活性降低的稱為抑制劑。很多少量的激活劑和抑制劑就會(huì)影響酶的活性，而且常具有特異性。本實(shí)驗(yàn)中氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。所以加入NaCl后，溶液顏色為淺黃色。氯離子促進(jìn)唾液淀粉酶的水解。銅離子作為抑制劑，故加入硫酸銅后，溶液顏色為深藍(lán)色。水作為對(duì)照變量，加入后對(duì)溶液稀釋，顏色為淺藍(lán)色。,結(jié)論（1）酶是一種活性蛋白質(zhì)，因此，

13、一切對(duì)蛋白質(zhì)有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性，受溫度、pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。（2）提取物在放置過程中變黑，是由于他們的組織中都含酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于組織內(nèi)部，當(dāng)內(nèi)部物質(zhì)暴露于空氣中，在氧的參與下將發(fā)生反應(yīng)，生成黑色素。（3）酶的催化作用，只有在一定溫度下才能體現(xiàn)出來。酶在低溫下活性暫時(shí)被抑制，高溫時(shí)會(huì)永久失活。,參考文獻(xiàn)： [1] KenllnerR,Mer

14、metJM,OttoMWindmerHM.Analytical Chemistry.Chapter6.Weiheim:Wiley VCH，1998;北京大學(xué)、吉林大學(xué)合譯．分析化學(xué)．北京:北京大學(xué)出版社，2000．第6章 [2] 王希成編．生物化學(xué)（第3版）．北京：清華大學(xué)出版社2010．第4章 [3] StryerL編，唐有棋等譯．生物化學(xué)．北京:北京大學(xué)出版社，1990 [4] Frieclman M E,D