青霉素類藥物工業(yè)分析與檢測方法

1、青霉素類藥物工業(yè)分析與檢測方法,生物工程一班小組成員：周春媛 莊超 戚嘉卓,抗生素類藥物專題,第一部分：青霉素類藥物生產(chǎn)工藝,菌種優(yōu)化,抗生素發(fā)酵及提取精制,工業(yè)生產(chǎn)方法及總的工藝,,,,抗生素生產(chǎn)菌的菌種,,,菌種來源,,抗生素工業(yè)生產(chǎn),內(nèi) 容 速 覽,抗生素總的生產(chǎn)工藝過程,菌種,孢子制備,種子制備,發(fā)酵,發(fā)酵液預(yù)處理及過濾出廠檢驗(yàn),提取過程成品包裝,精制過程成品檢驗(yàn),,,,,,,,,,微

2、生物合成抗生素,,下游： 提取 預(yù)處理 過濾 進(jìn)一步提取,,菌種保存、選育、孢子及種子制備發(fā)酵——適宜的培養(yǎng)基碳源 氮源 無機(jī)鹽（微量元素）前體,,上游：,結(jié)晶干燥,,,,,純品,,成品:,制劑工作,★發(fā)酵控制,1）發(fā)酵時(shí)間：視抗生素品種和發(fā)酵工藝而定。2）溶 氧：在整個(gè)發(fā)酵過程中，需不斷通無 菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。3）控制灌溫：在罐的

3、夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。4）消 泡： 加泡沫劑以控制泡沫，必要時(shí)還加入酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。,成品檢驗(yàn)《中華人民共和國藥典》,抗生素成品常規(guī)檢驗(yàn)的主要項(xiàng)目有： ①鑒別實(shí)驗(yàn)：用化學(xué)或生物方法證明是何種抗生素； ②效價(jià)測定：測定有效成分的含量； ③毒性試驗(yàn)：限制產(chǎn)品中的致毒雜質(zhì),⑤水分測定：限制過高水分以免影響穩(wěn)定性；,④無菌實(shí)驗(yàn)：檢查有無雜菌污染；,⑥pH測定：規(guī)定水溶液的酸堿度，保

4、證產(chǎn)品穩(wěn)定 和臨床的安全應(yīng)用；,第二部分：青霉素類藥物的分析與檢測,,（一）、鑒別實(shí)驗(yàn),一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),1、化學(xué)結(jié)構(gòu) ①   青霉素類結(jié)構(gòu),,青霉素類: 氫化噻唑環(huán)或氫化噻嗪環(huán)與β-內(nèi)酰胺并合的雜環(huán)，分別構(gòu)成二者的母體：6-APA、 7-ACA。 母核: 由?-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán) 組成的雙雜環(huán)。 6-APA 6-Am

5、inopenicillanic Acid 側(cè)鏈 : RCO-,2、性質(zhì) 青霉素類和頭孢菌素類結(jié)構(gòu)共同特點(diǎn)具有?-內(nèi)酰胺環(huán)。青霉素分子中都有一個(gè)游離羧基和酰胺側(cè)鏈。,①   酸性,,有羧基，具有酸性 pKa值在2.5~2.8之間 與堿成鹽如：青霉素G鈉、青霉素G鉀等分子中游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性，能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿形成鹽。其堿金屬鹽易溶于水，而有機(jī)堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑。,② 

6、 旋光性,青霉素分子中含有三個(gè)手性碳原子(C3，、C5、C6)有手性碳原子，具有旋光性，根據(jù)此性質(zhì)，可用于青霉素藥物的定性和定量分析,③紫外吸收特性,青霉素類 母核無明顯UV多數(shù)有苯環(huán)取代基,＊ 但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產(chǎn)生具有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。 ＊ 側(cè)鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物，在紫外光區(qū)也有吸收。像芐青霉素。,頭孢菌素類分子中有共軛體系（O＝C－N－C＝C）在260nm處有最大吸收。,④

7、不穩(wěn)定性,干燥條件下青霉素鹽穩(wěn)定。青霉素水溶液在pH6-6.8時(shí)較穩(wěn)定。 β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定的部分。不穩(wěn)定性因素：四元環(huán)張力大 ， 酰胺鍵易水解青霉素類藥物遇到某些氧化劑（酸、堿、青霉素酶，或某些金屬離子）或遭遇某種溫度，藥物將降解失效。,二、青霉素類藥物的鑒別反應(yīng),（一）官能團(tuán)的呈色反應(yīng)：1、 羥肟酸鐵反應(yīng)：堿性環(huán)境中與羥胺作用β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸在稀酸中與高鐵離子呈色 。【鑒別】（1）取本品約2

8、0mg，加水15ml溶解后，加鹽酸羥胺試液與氫氧化鈉試液各2ml，放置5分鐘后，加鹽酸溶液（1→100）3ml與三氯化鐵試液1ml，隨即振搖，即顯赤褐色。,2、硫酸-硝酸呈色反應(yīng)：頭孢菌素能與硫酸-硝酸反應(yīng)后呈黃色。此顯色反應(yīng)可區(qū)別某些頭孢菌素族抗生素，因此被一些國家藥典采用供鑒別。3、茚三酮反應(yīng)：α-氨基酸的反應(yīng),如氨芐西林遇茚三酮顯藍(lán)紫色4、與斐林試劑反應(yīng)：分子中具有(-CONH-)結(jié)構(gòu)，可使堿性酒石酸銅還原顯紫色, 5、變

9、色酸-硫酸呈色反應(yīng)：中國藥典(1995年版)采用本法鑒別。如阿莫西林林加變色酸-硫酸試劑混合后，于150℃加熱2-3min，因分解出甲醛與變色酸縮合而呈深褐色。 6、各種鹽的反應(yīng)：火焰反應(yīng)在火焰下遇鉀顯紫色遇鈉顯淡黃色青霉素族、頭孢菌素族藥品中，許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用，因而可利用其火焰反應(yīng)進(jìn)行鑒別。,（二）沉淀反應(yīng),1、在稀鹽酸中生成白色沉淀：青霉素鉀(鈉) 白色游離基沉淀,2、 有機(jī)胺鹽的特殊反應(yīng)：,側(cè)鏈含有苯羥基基團(tuán)時(shí)，

10、能與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合反應(yīng)而呈色。如：,（三）類似肽鍵的反應(yīng),雙縮脲反應(yīng),【鑒別】（2）取樣本約10mg，加水6ml溶解后，加堿性酒石酸銅試液0.5ml，即顯紫色。,(四)生物學(xué)法（抑菌能力）,如青霉素鈉 鑒別 取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50μg的溶液，各取1ml ，加入不少于200 單位的青霉素酶溶液1ml,在37℃滅活1小時(shí)后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布

11、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時(shí)后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。,二、藥物中有效物質(zhì)含量測定,（1）容量法：容量分析是依據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)試劑溶液與被測定的一定量供試品藥物完全作用所消耗的標(biāo)準(zhǔn)試劑的體積，來計(jì)算被測定藥物中有效物質(zhì)含量的方法。在抗生素類藥物分析中，常用的有酸堿滴定法、碘量法。青霉素含量的測定,青霉素在水溶液中經(jīng)水解后，產(chǎn)生青霉噻唑酸，可用酸堿

12、滴定法測定?；蛴弥苯拥味ǚǎ蛴媚娴畏ㄟM(jìn)行測定，最后均以堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量來計(jì)算青霉素的含量。,,終點(diǎn)觀察：用目視指示劑或電位滴定均可。溫度對指示劑的變色范圍有影響。堿性指示劑，溫度升高時(shí)，對氫離子的靈敏度降低，變色范圍偏向較低的pH值，如甲基橙在室溫時(shí)為pH 3.1～4.4，在100℃時(shí)，移到2.5～3.7。酸性指示劑對溫度的影響不太敏感。指示劑的用量不宜多，過多時(shí)，因指示劑本身也消耗酸或堿，變色較慢。在水溶液中，大部分羧酸在pH約8

13、.4時(shí)中和，一般可用酚酞指示劑（無色到紅色），也可采用百里酚酞（無色到藍(lán)色）或百里酚藍(lán)（黃色到藍(lán)色）等。滴定劑的選擇，一般選用氫氧化鈉或氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液作滴定劑。標(biāo)準(zhǔn)堿液一般采用新沸冷卻蒸餾水進(jìn)行稀釋制備。貯存標(biāo)準(zhǔn)堿液的容器要密封，以免吸收二氧化碳而影響堿液質(zhì)量。青霉素鈉的含量測定精密稱取本品約0.3～0.4g，加新沸過的蒸餾水20mL使其溶解，加0.01mol/L氫氧化鈉液中和后，精密加0.1mol/L氫氧化鈉液25mL，95℃左右水

14、浴20min。冷卻后，加酚酞指示劑2滴，用0.1mol/L鹽酸滴定，從粉紅色至無色。不加供試樣品作為空白，重復(fù)以上操作。兩者滴定數(shù)的差即為所消耗氫氧化鈉的量。,（2）光譜學(xué)測定法,①旋光法:平面偏振光通過含有某些光學(xué)活性的化合物液體或溶液時(shí)，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的平面向左或向右旋轉(zhuǎn)。偏振光平面旋轉(zhuǎn)的度數(shù)，稱為旋光度。使偏振光向右旋轉(zhuǎn)（順時(shí)針方向）為右旋，以“＋”符號表示；使偏振光向左旋（逆時(shí)針方向）為左旋，以“－”符號表示。偏振光透

15、過長1dm并每1mL中含有旋光物質(zhì)1g的溶液，在一定波長與溫度下測得的旋光度稱為比旋度。旋光法亦用于紅霉素、螺旋霉素等的效價(jià)測定。,②分光光度法:紫外分光光度法多用于抗生素制劑中抗生素含量的測定。如測定奧格門汀（復(fù)合制劑）中羥氨芐青霉素和克拉維酸的含量；測定麥迪霉素膠囊中麥迪霉素的含量；用金屬離子絡(luò)合物測定土霉素制劑中的土霉素含量等等。比色法用于多種抗生素的效價(jià)測定。如青霉素和頭孢菌素的羥胺比色法測定抗生素效價(jià)；鏈霉素的麥芽酚法測定鏈

16、霉素效價(jià)；三氯化鐵比色法測定土霉素效價(jià)等。,③色譜法測定法 色譜法在抗生素藥物分析中，主要用于鑒別定性及定量（如雜質(zhì)、異構(gòu)體的限度試驗(yàn)和組分分析）。,④高效液相測定法：在每種抗生素進(jìn)行檢測前要求對儀器進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子。高效液相色譜在抗生素類藥物的定性、定量分析中應(yīng)用的愈來愈多，如半合成青霉素的衍生物的含量測定。,（3）碘量

17、法（剩余碘量法）,原理,*β－內(nèi)酰胺類不直接與碘反應(yīng)*β－內(nèi)酰胺類水解產(chǎn)物可與碘發(fā)生定量反應(yīng)：,取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，精密稱取約0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氫氧化鈉溶液1ml放置20分鐘，再加1mol/L鹽酸溶液1ml與醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml,精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在20~25℃暗處放置20分鐘，用硫代

18、硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液，繼續(xù)滴定并強(qiáng)力振搖，至藍(lán)色消失；另精密量取供試品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，搖勻，在暗處放置20分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液（0.01mol/L）滴定，作為空白。同時(shí)用青霉素對照品同法測定作對照，算出供試品的含量。,（4）電位配位滴定法——汞量法,1. 原理,*β－內(nèi)酰胺類不直接與汞鹽反應(yīng)

19、*β－內(nèi)酰胺類水解產(chǎn)物可與汞鹽,2.青霉胺發(fā)生定量反應(yīng)：青霉素藥物與硝酸汞發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。先按2分子青霉胺與1分子汞離子的比例絡(luò)合，發(fā)生第一次滴定突躍，但突躍范圍很小，變化比較平緩，不宜用于做終點(diǎn)，繼續(xù)用硝酸汞滴定時(shí)，青霉胺分子與汞離子按1:1的比例絡(luò)合，生成穩(wěn)定的絡(luò)合物——青霉胺絡(luò)汞，發(fā)生第二次滴定突躍。其突躍范圍較大，變化較急劇，宜于確定終點(diǎn)。計(jì)算青霉素胺含量并進(jìn)行結(jié)果討論：（1）電位法指示終點(diǎn)，以第二次滴定 突躍為終點(diǎn)

20、 反應(yīng)摩爾比1:1 （2）空白試驗(yàn) 用未降解樣品測定（3）優(yōu)點(diǎn) 不需標(biāo)準(zhǔn)品,三、抗生素效價(jià)測定和微生物檢定法,1、稀釋法：稀釋法是抗生素效價(jià)測定最簡單的方法之一。一般是在一系列的試管中用液體培養(yǎng)基逐管將抗生素做2倍稀釋，并于各個(gè)試管中加入同量的對該抗生素有高度敏感性的試驗(yàn)菌液。將各個(gè)試管放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察能抑制細(xì)菌生長的最低抗生素濃度作為測定終點(diǎn)。再與同法測得的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品終

21、點(diǎn)做比較，即可求得被測定抗生素的效價(jià)。,2、比濁法：細(xì)菌生長產(chǎn)生的濁度與細(xì)菌數(shù)的增加、細(xì)菌群體質(zhì)量的增加和細(xì)菌細(xì)胞容積的 增加之間，存在著相關(guān)性，在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液與供試品的稀釋液分別加入試管中，再加入已接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基，搖勻，置37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察試驗(yàn)菌生長情況。由于抗生素濃度不同，試驗(yàn)菌受抑制的程度也不同，因而產(chǎn)生不同程度的混濁。用分光光度計(jì)測定其透光率或吸收度，用標(biāo)準(zhǔn)曲

22、線法可測定出供試品的效價(jià)。取每mL含24.0、26.8、29.9、33.5和37.5U的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1mL，分別加入15支試管中(3個(gè)平行)。另取試管3支，每管中各加入供試品溶液1mL。于18支試管中各加入已接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9mL，搖勻。將標(biāo)準(zhǔn)品管和供試品管置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h后，取出，分別于每管中各加入12％甲醛溶液0.5mL，搖勻，即可于分光光度計(jì)上530nm處以未接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9mL，加蒸餾水1mL，1

23、2％甲醛溶液0.5mL，搖勻作為空白，測定各管內(nèi)培養(yǎng)物的透光率。以透光度為縱坐標(biāo)，鏈霉素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出供試品的效價(jià)。,3、瓊脂擴(kuò)散法：,（即管碟法)管碟法是目前國際上測定抗生素效價(jià)的通用方法。我國藥典收載的微生物檢定法也是管碟法。此法靈敏度高，但操作較麻煩，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素較多，需要從各個(gè)操作步驟嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，盡可能減小試驗(yàn)誤差，才能使試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到精密、準(zhǔn)確。,管碟法的原理：管碟法是利用抗生素在攤

24、布特定試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖，通過透明瓊脂培養(yǎng)基，可觀察到透明的抑菌圈。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對數(shù)濃度（劑量）與抑菌圈面積或直徑成正比。方法設(shè)計(jì)是在同樣條件下將已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價(jià)的供試品溶液的劑量反應(yīng)（抑菌圈）進(jìn)行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，對一定試驗(yàn)菌所得的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計(jì)為一劑

25、量法、二劑量法及三劑量法等，從而可以較為準(zhǔn)確地測定供試品的效價(jià)。,四、青霉素藥物雜質(zhì)檢查,高分子雜質(zhì) ——分子量大于青霉素藥物本身的雜質(zhì)總稱。外源性雜質(zhì)蛋白、多肽、多糖或抗生素與蛋白、多肽、多糖的結(jié)合物。主要來自于發(fā)酵工藝，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。雜質(zhì)分類：基本特點(diǎn)－對青霉素而言,青霉噻唑多肽－外源性的（2400～3500）青霉素聚合物－內(nèi)源性的（聚合度）母核參與的聚合反應(yīng)－N型聚合反應(yīng),側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)－L型聚合反

26、應(yīng),特點(diǎn)：,（1）生產(chǎn)過程中的任何蛋白或碎片都可帶入產(chǎn)品中，易與藥物形成多肽類雜質(zhì)（2）形成的聚合物也可發(fā)生不同程度的降解（3）異構(gòu)體之間可以相互聚合－L-L、D-D、L-D（4）高分子雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝密切相關(guān),高分子雜質(zhì)的控制方法1、凝膠色譜－自身對照外標(biāo)法*凝膠色譜法：利用凝膠的分子篩作用，讓藥物分子自由的進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)被排阻的原理進(jìn)行的。故此大分子則先流出色譜柱，小分子后出峰而得以分離。*分析方法：1、

27、HPLC系統(tǒng) 2、簡單測定系統(tǒng)3、色譜適用性條件：（1）藍(lán)色葡聚糖在高分子分離中的 N＞2500/m，拖尾因子0.75～1.5（2）峰面積的RSD＜5％,2、分子排阻色譜法,【檢查】青霉素聚合物 填充劑 葡聚糖凝膠G-10（40~120µm） 流動相A 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0） [0.1mol/LNa2HPO4-0.1mol/LN

28、aH2PO4(61:39)] 流動相B 水 流速 1.5ml/min 檢測波長 254nm,對照溶液的制備 取青霉素對照品適量，精密稱定，加水制成100ug/ml溶液，搖勻。以流動相B測定。供試品溶液，取供試品適量，精密稱定，加水制成，20ug/ml進(jìn)樣。以流動相A測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。（自身對照外標(biāo)法）含聚合物按青霉素計(jì)，不得超過0.3%。,3、 分光光度法：,取本品，加水制成