項目一血液標(biāo)本采集和血涂片制備

1、,臨床檢驗基礎(chǔ) 鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗教研室,血液一般檢驗,臨床檢驗者準(zhǔn)入、獲取專業(yè)技術(shù)資格考試的必考課程之一，該考試設(shè)置“基礎(chǔ)知識”、“相關(guān)專業(yè)知識”、“專業(yè)知識”和“專業(yè)實踐能力”四個科目，其中臨檢所占題量和分值約20%，位居各檢驗之首。,臨床檢驗基礎(chǔ)又稱為實驗診斷學(xué)，是通過實驗室的各種檢查方法，包括感官檢查、理學(xué)檢查、化學(xué)檢查、顯微鏡檢查以及自動化儀器檢查，對離體的血液、體液、分泌物和排泄物、脫落細(xì)胞等標(biāo)本進(jìn)

2、行化學(xué)、病原生物學(xué)、顯微鏡形態(tài)學(xué)的檢查、分析，以獲得有關(guān)病原、病理生理變化及臟器功能狀態(tài)等實驗資料，從而協(xié)助臨床對疾病進(jìn)行篩檢、診斷和鑒別診斷。,臨床檢驗基礎(chǔ)的概念,自動化儀器檢查:電子計算機技術(shù)、自動化檢驗儀器取代手工法。速度快、精度高、操作易、參數(shù)多、易質(zhì)控、信息大等。,感官檢查:直接觀察標(biāo)本：顏色、透明度、性狀，有無凝塊或寄生蟲,臨床檢驗的一般方法,理學(xué)檢查:液體的相對密度、血液比粘度、紅細(xì)胞沉降率、紅細(xì)胞比積等病理變化,化學(xué)檢查

3、:定性或定量檢測標(biāo)本化學(xué)成分的病理變化,顯微鏡檢查: 觀察有形成分的數(shù)量和形態(tài),,手工法自動化儀器法,現(xiàn)代臨床檢驗的特點:檢驗操作的自動化、檢驗技術(shù)的現(xiàn)代化、檢驗方法的標(biāo)準(zhǔn)化、檢驗試劑的商品化、計量單位的國際化、質(zhì)量管理的全程化,臨床檢驗工作流程與質(zhì)量控制,正確的標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運是降低結(jié)果差錯率（可減少70%以上）的關(guān)鍵。標(biāo)本采集原則：保持當(dāng)時生理或病理狀態(tài)下離體標(biāo)本質(zhì)和量的完整性。及時送檢,臨床檢驗在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,1、為疾病診斷和鑒

4、別診斷提供客觀的實驗室檢查依據(jù) 發(fā)熱、出血、貧血傾向的患者：血涂片檢查到大量原幼紅細(xì)胞可診斷為急性白血病。白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）數(shù)量增多、血沉增快：支持急性心肌梗死的診斷，可與心絞痛相鑒別。顯微鏡發(fā)現(xiàn)病原體是確診感染性疾病的依據(jù)。,2、為疾病療效監(jiān)測和預(yù)后判斷提供動態(tài)變化數(shù)據(jù) 尿蛋白檢測：檢測腎臟疾病患者的病情變化；網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)：對貧血患者、進(jìn)行發(fā)射治療或化學(xué)治療的患者骨髓造血功能判斷具有實際可靠的指導(dǎo)作用。

5、3、為疾病預(yù)防提供檢測依據(jù) 預(yù)防為主是基本方針，從標(biāo)本中檢測寄生蟲，可對感染人群進(jìn)行必要的治療和隔離，防止疾病的傳播和傳染。,學(xué)習(xí)的基本要求,1.熟練掌握臨檢的基本理論。（生理學(xué)、病理學(xué)基礎(chǔ)，檢驗基本理論）,2.掌握檢驗的基本實驗技能。（標(biāo)本的采集、規(guī)范操作、質(zhì)量控制等）,3.熟悉檢驗方法學(xué)的評價。（評估和選擇靈敏度高、特異性強的檢驗方法，正確分析比較手工檢驗方法和儀器檢驗方法的優(yōu)缺點）,4.熟悉檢驗項目的參考值和臨

6、床意義。(記憶常用檢驗項目的參考值，以便結(jié)合臨床，對檢驗結(jié)果進(jìn)行有效的分析）,勤學(xué)苦練,重點：1.血標(biāo)本采集方法和血涂片制備技術(shù) 2.抗凝劑的應(yīng)用難點：血細(xì)胞染色原理,項目一 血液標(biāo)本采集和血涂片制備,一. 掌握血液標(biāo)本的采集方法及注意事項。 二. 熟悉常用的血液抗凝劑種類及其應(yīng)用。三、掌握血涂片的制備與細(xì)胞染色原理。,血液組成,概述,概述,血液理化性質(zhì),1.血量：成人4～5L，占體重

7、6%～8%2.顏色：動脈鮮紅，氧合血紅蛋白多 靜脈暗紅，還原血紅蛋白多3.PH：7.35～7.45，動脈稍高，靜脈稍低4.比密和滲透濃度：血液比密取決于血細(xì)胞比容和hb量：男：1.055～1.063; 女：1.050～1.060;血漿比密與其血漿蛋白質(zhì)含量有關(guān)：1.025～1.030；血細(xì)胞比密：1.090 血漿滲量（滲透壓）= 290～310mOsm/kg.H2O，5.血液特性：懸浮穩(wěn)定

8、性；粘滯性；凝固性,概述,血液生理功能,1.運輸功能（基本功能）2.協(xié)調(diào)功能（輸送激素、酶類到各個臟器）3.維護(hù)機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性（酸堿平衡、電解質(zhì)代謝、體溫恒定）4.防御功能（白細(xì)胞、抗體、補體等）,任務(wù)一 血液標(biāo)本的采集及抗凝,一、采血部位,毛細(xì)血管采血法,成人：左手無名指或中指指端內(nèi)側(cè)(WHO),嬰幼兒：大拇趾,血液標(biāo)本的采集,耳垂：,不宜使用,手指,,適用于需血量少(<0.1ml)的檢查。,或

9、 內(nèi)外側(cè)緣,足跟,嚴(yán)重?zé)齻颊撸浩つw完整處,？,毛細(xì)血管采血法,血液標(biāo)本的采集,二、器材與試劑：無菌一次性采血針、一次性微量吸管、消毒干棉球、無菌干棉球、小試管、75%乙醇、生理鹽水等。,按摩：輕輕按摩采血部位，使其自然充血。消毒：用75%乙醇消毒棉球消毒。,針刺：待酒精揮發(fā)干后，用左手拇指和食指 捏緊采血部位，右手持采血針，迅速刺入2～3mm。,拭血：待血自然流出后，無菌干棉球擦去第一滴血。吸血：按

10、需要依次采血采血完畢，用干棉球壓住傷口片刻。稀釋：無菌干棉球擦凈吸管外余液，將吸管伸入裝有生理 鹽水的試管底部，慢慢排除吸管內(nèi)的血液，上清液清洗管內(nèi)余血2～3次。將試管內(nèi)的液體混勻。,三、操作步驟,毛細(xì)血管采血法,血液標(biāo)本的采集,1、準(zhǔn)備2、按摩3、消毒4、針刺5、拭血6、吸血7、稀釋,四、注意事項,1.采血部位不能有凍瘡、紫紺、水腫和炎癥等。,2.消毒后，待酒精干后采血。,3.取血時切忌用力擠壓。,4

11、.進(jìn)行多項檢查時，采集標(biāo)本的順序依次為: PLT計數(shù)、RBC計數(shù)、Hb測定、WBC計數(shù)及分類、血型鑒定等。,毛細(xì)血管采血法,血液標(biāo)本的采集,毛細(xì)血管采血法,血液標(biāo)本的采集,五、方法學(xué)評價,1. 操作方便；2. 每人的皮膚厚度不同，無法控制 采血刺入的深度；3. 常需擠壓誘導(dǎo)，導(dǎo)致組織液混入， 影響結(jié)果準(zhǔn)確性；4. 標(biāo)本不能重復(fù)應(yīng)用；5. 取血量少(<0.1ml)。,1.毛細(xì)血管采血時應(yīng)

12、注意些什么？2.選擇題：1）新生兒做血細(xì)胞計數(shù)，多用下列哪個部位采血 A.手背 B.耳垂 C.足跟 D.左手無名指2）關(guān)于毛細(xì)血管采血法，下列正確的是 A.耳垂血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血細(xì)胞比容結(jié)果均比靜脈血低10%左右 B.手指采血時流出的第一滴血即可用于檢查 C.嬰兒宜用耳垂或手指采血D.成人推薦用手指采血，因其檢查結(jié)果比較恒定,復(fù)習(xí)思考題,一、采血部位,常用肘部靜脈,也可手背或外踝靜脈等。,二、器材

13、與試劑,注射器、壓脈帶、墊枕、75%酒精、碘酒、無菌棉簽(球)等。,靜脈采血法,血液標(biāo)本的采集,用于需血量較多或全自動血液分析儀測定。,四、注意事項,1.防止標(biāo)本溶血。2.壓脈帶壓迫時間不能過長。3.切忌將注射器往靜脈內(nèi)推。,三、采血步驟,靜脈采血法,血液標(biāo)本的采集,毛細(xì)血管采血與靜脈采血優(yōu)缺點比較,血液標(biāo)本的采集,優(yōu)點：防溶血 防標(biāo)本污染 防交叉感染 可多管采集,缺點：成本較高,血液標(biāo)本的采集

14、,一次性使用靜脈采血針,瓶塞穿刺針套（防止血液泄漏）,,抗凝：用物理或化學(xué)的方法，去除或抑制某些凝血因子，阻止血液凝固。,概念,血液標(biāo)本的抗凝,物理方法抗凝：脫纖維蛋白將血液注入到有玻璃珠的器皿中，轉(zhuǎn)動，纖維蛋白纏繞凝固在玻璃球上，從而防止血液凝固成塊。適用于免疫學(xué)檢驗、紅斑性狼瘡細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng)血培養(yǎng)基的制備。,常用抗凝劑：枸櫞酸鈉、草酸鈉、二草酸鹽、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)、肝素,抗凝劑(anticoagulant)：能夠阻止

15、血液凝固的化學(xué)試劑或物質(zhì)。,一.枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）,適用項目：凝血象檢查、紅細(xì)胞沉降率、 血液保養(yǎng)液,常用的抗凝劑,血液標(biāo)本的抗凝,抗凝原理：與血中鈣離子結(jié)合形成螯合物,二.草酸鈉,三.雙草酸鹽抗凝劑,抗凝原理：與鈣離子形成草酸鈣沉淀。,適用項目：血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞(計數(shù)）,草酸鉀(鈉)使RBC皺縮，草酸銨使RBC脹大。,常用的抗凝劑,血液標(biāo)本的抗凝,不適于血小板計數(shù)和白細(xì)胞分類計數(shù),四.乙二胺四乙酸（EDTA）鹽,抗凝原理：與鈣離子

16、結(jié)合形成螯合物,適用項目：EDTA-K2用于血細(xì)胞計數(shù)(ICSH) 血細(xì)胞比容測定,常用的抗凝劑,血液標(biāo)本的抗凝,不適于凝血象檢查及血小板功能試驗。,五.肝素,適用項目：紅細(xì)胞滲透脆性試驗、血細(xì)胞比容測定 血液流變學(xué)檢查、多種生化分析,抗凝原理：加強抗凝血酶Ⅲ滅活絲氨酸蛋 白酶，從而阻止凝血酶形成、抑制血小板聚集。,不適于白細(xì)胞計數(shù)及分類計數(shù),常用的抗凝劑,血液

17、標(biāo)本的抗凝,臨床常用的采血試管,血液標(biāo)本的抗凝,檸檬酸鈉抗凝（抗凝比例1：9）用于凝血象檢查,加入促凝劑，用于普通生化檢查,EDTA-K2抗凝，用于血常規(guī)檢查,肝素鈉抗凝，用于血流變學(xué)檢查等,檸檬酸鈉抗凝（抗凝比例1：4）用于紅細(xì)胞沉降率的測定,1.毛細(xì)血管采血時應(yīng)注意些什么？2.常用的血液抗凝劑有哪些？3.選擇題：1）新生兒做血細(xì)胞計數(shù)，多用下列哪個部位采血 A.手背 B.耳垂 C.足跟 D.左手無名指2）關(guān)

18、于毛細(xì)血管采血法，下列正確的是 A.耳垂血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血細(xì)胞比容結(jié)果 均比靜脈血低10%左右 B.手指采血時流出的第一滴血即可用于檢查 C.嬰兒宜用耳垂或手指采血,復(fù)習(xí)思考題,3）不與Ca2+作用,但能阻止血液凝固的抗凝劑是 A.草酸鹽 B.EDTA-K2 C.肝素 D.枸櫞酸鈉4）下列幾種抗凝劑，哪種最適宜用于血細(xì)胞計數(shù) A. 乙二胺四乙酸二鉀(EDTA－K2) B.枸櫞酸鈉

19、C.草酸鈉 D.草酸鉀 5）肝素作為抗凝劑,下列敘述錯誤的是 A.具有較強的抗凝能力 B.不影響血細(xì)胞體積 C.過量使用可引起白細(xì)胞聚集 D.適用于做白細(xì)胞分類計數(shù),,血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值，近年來血細(xì)胞分析儀的廣泛應(yīng)用，血涂片的觀察也可作為判斷儀器結(jié)果的簡易方法。 血涂片的用途：血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗、網(wǎng)

20、織紅、 寄生蟲檢驗。,任務(wù)二 血涂片制備和細(xì)胞染色,一、手工推片法,將推玻片向1的方向稍抽回，當(dāng)血液充滿推玻片的寬度后，以一定均勻的速度向2的方向滑動。,,圖1-3 血涂片制備示意圖（上：側(cè)面觀，下：正面觀）,,,,,,,,,,血涂片制備,推片,載玻片,血液,,,,將推片勻速向前，勿停頓。涂片的厚薄取決于速度和角度：快、大(厚)。慢、小（?。?一張滿意的血涂片應(yīng)厚薄均勻 頭 體 尾鮮

21、明,,,,,,,,涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫上姓名和編號,李四,B 1 2 3,,血涂片的觀察,低倍鏡觀察1.染色情況(滿意、偏酸、偏堿）2. 細(xì)胞分布情況油鏡下分類計數(shù)：體尾交界處。油鏡分類時應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計數(shù)。,,,,,,,,,,,,,,,,李四123,適宜,不適宜,不適宜,二、血液涂片染色,對細(xì)胞核著色較好,對細(xì)胞質(zhì)著色較好,瑞氏染料的組成：由酸性染料伊紅和堿性染料亞甲藍(lán)組成的復(fù)合染料溶于甲醇制備而成。

22、堿性染料：為陽離子染料，能接受質(zhì)子，細(xì)胞核的染料。如亞甲藍(lán)、天青。能結(jié)合酸性物質(zhì)并染色，如淋巴細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞染成藍(lán)色酸性染料：為陰離子染料，能釋放質(zhì)子。如伊紅。能結(jié)合細(xì)胞的堿性成分并染色，如血紅蛋白、嗜酸性顆粒成分等染成紅色。,（一）瑞氏染色法,固定著色合并進(jìn)行，簡便，染色時間短，WBC特異性顆粒著色較好，細(xì)胞核著色較差。,細(xì)胞染色原理：,一般以它們的物理現(xiàn)象和/或化學(xué)現(xiàn)象為依物理作用：毛細(xì)管現(xiàn)象、滲透、吸收、吸附作用等化學(xué)

23、作用：a. 染料的化學(xué)成分：助色基團的存在，堿性染料在溶媒中為陽離子型，易與組織和細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電荷的酸性物質(zhì)結(jié)合；而酸性染料在溶媒中為陰離子型，與帶正電荷的堿性物質(zhì)結(jié)合。,b. 蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)：蛋白質(zhì)中的氨基酸含有不同 數(shù)量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同時還有其 它活性基團。在游離狀態(tài)時， -NH2獲得一個H+變成 帶正電的-NH3+，而-COOH失去一個H+變成帶負(fù)電的-COO-。分別與不同染料結(jié)合。c

24、. 周圍環(huán)境的酸堿度：如環(huán)境pH＜pI，則蛋白質(zhì)帶正電，結(jié)合酸性染料；反之，pH＞pI，則結(jié)合堿性染料。,細(xì)胞染色法的類型,普通染色法： 經(jīng)物理和/或化學(xué)作用的吸附、結(jié)合熒光染色法：熒光染料，熒光顯微鏡細(xì)胞活體染色法：活體染料如燦爛甲酚藍(lán)等細(xì)胞化學(xué)染色法：用化學(xué)反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)某種成分細(xì)胞免疫化學(xué)染色法（應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)）,瑞氏染色法,[瑞氏染料] 由酸性染料伊紅（eosin,E-）和堿性染料亞甲藍(lán)(me

25、thylene blue,M+)組成的有機復(fù)合染料。亞甲藍(lán)為四甲基硫堇染料，有對醌型和鄰醌型兩種結(jié)構(gòu)。通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)。美藍(lán)容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料。市售美藍(lán)中部分已被氧化為天青。伊紅通常為鈉鹽。將伊紅和美藍(lán)溶解在甲醇中，即瑞氏染料。,[染色原理],細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，,例

26、如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性蛋白質(zhì)，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。 M+Cl + Na+E → ME + NaCl 美藍(lán) 伊紅 伊紅化美藍(lán)（瑞氏染料）,,圖1-4 瑞氏染色原理示意圖,嗜堿性粒細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,嗜多色性紅細(xì)胞,中性粒

27、細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞,[試劑],Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml甲醇：有強大的脫水力，可將細(xì)胞固定為一定形態(tài)， 并使蛋白質(zhì)沉淀為顆粒狀、網(wǎng)狀等結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞與染料接觸表面積，提高對染料的吸附作用，增強染色效果。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸氫二鈉（無水）0.2g, 蒸餾水加到1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH，塞緊瓶口備用。,[染色方法],1

28、. 用蠟筆在血膜兩頭劃線，平放于染色架上。2. 加瑞氏染液覆蓋血膜，固定1min。3. 滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。4. 用清水沖洗，待干后鏡檢。,【質(zhì)量控制】,血膜要干透后才能染色，否則染色時易脫落.染色時間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時間長些效果好。染液不能過少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時間也不能長。染色過淡，可復(fù)染。染色過深可用水沖

29、洗或浸泡，還可用甲醇脫色.,中性桿狀核粒細(xì)胞,嗜酸性粒細(xì)胞,嗜堿性粒細(xì)胞,姬姆薩染色法,[原理] 吉姆薩染液由天青，伊紅組成。染色原理和結(jié) 果與瑞特染色法基本相同。但本法對細(xì)胞核和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更不清晰，而胞質(zhì)和中性顆粒則著色較差。為兼顧二者之長，可用復(fù)合染色法。即以稀釋吉姆薩液代替緩沖液，按瑞特染色法染10min?；蛳扔萌鹛厝旧ㄈ旧螅儆孟♂尲匪_復(fù)染。,吉姆薩染料 1.0g 甘油

30、 66.0ml甲醇（AR） 66.0ml[染色方法] 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 將血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水沖洗,待干后鏡檢,[試劑],瑞氏-吉姆薩染色,【原理】 將瑞特染料和吉姆薩染料按一定比例混合后對細(xì)胞進(jìn)行染色，其染色原理同瑞特和吉姆薩染色法，但染色效果更佳，因為其綜合了瑞氏和吉

31、姆薩染色法的優(yōu)點。,【試劑】,瑞特染料 1.0g吉姆薩染料 0.3g甲醇（AR) 加至500ml 先將瑞特染料和吉姆薩染料充分研磨混勻，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的繼續(xù)加入甲醇研磨，重復(fù)多次，最后把染液加至500ml。,[染色方法],血片加滴加染液5滴，并立即將染液蓋滿血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸鹽緩沖液（同瑞氏染液）10滴，10min后用流水沖洗干凈，待干后鏡檢。,【質(zhì)

32、量控制】,同瑞氏染色法,【方法學(xué)評價】,瑞氏染液和吉姆薩染液對細(xì)胞進(jìn)行染色時有各自的顯色特征，前者對細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將二者結(jié)合，能取長補短、集中優(yōu)勢，用該混合染液對血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對比鮮明。瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。,巴氏染色法,是脫落細(xì)胞染色法中較好的染色方法。,(a)刺入靜脈,(b)靜脈抽血,(c)針頭抽出,(d)注入試管,步驟1.采血