第十四章生殖工程——試管嬰兒

1、第十章 生殖工程—試管嬰兒,人工授精、試管嬰兒、克隆技術(shù),,生殖工程發(fā)展簡史200年前，John Hunter用注射器將一位尿道下裂的丈夫的精液注入妻子的陰道內(nèi)懷孕。1953年，第一例冷凍精子人工授精成功，但人工授精技術(shù)一直到70年代才廣泛應(yīng)用于臨床1983年，我國首個利用冷凍精子人工授精嬰兒出生。1984年，美國William Pancoast首例報道供精人工受孕.1978年，世界第一例試管嬰兒Louis Brown在英國

2、劍橋大學(xué)誕生，開創(chuàng)體外授精治療不孕新的里程碑。1988年，我國第一例試管嬰兒出生,第一節(jié) 人工受精人工受精：收集丈夫或自愿獻精者的精液，由醫(yī)師注入女性 生殖道以達到受孕目的的一種技術(shù)。解決男性不育的主要方法必須具備的三個條件： 足夠數(shù)量和活力的精子 正常的排卵 至少一條輸卵管通暢和功能正常,,一、分類 依據(jù)精液來源分為：

3、夫精人工授精（AIH）：使用丈夫精子供精人工授精（AID）：自愿獻精者的精子 依據(jù)操作方法：子宮人工授精：宮腔內(nèi)授精、宮頸內(nèi)授精、陰道內(nèi)授精輸卵管內(nèi)精液灌注：是人工授精的一種新方法,,,二、接受人工授精婦女的條件 有規(guī)則的月經(jīng)周期 有正常排卵 輸卵管必須通暢 生殖器官無嚴(yán)重疾患三、AID供精者的選擇 挑選體力和智力俱佳的已婚青壯年男性

4、 仔細檢查精液質(zhì)量，排除一切遺傳病和性傳播性疾病 供方與受方不相識 兼顧供者血型、身高、膚色及頭發(fā)顏色是否與患者丈夫一致,,,,,,,,,五、人工授精治療程序（一）精液的采集和處理逆行射精者：采精前每4小時服碳酸氫鈉1克，使尿液pH值達 到7.2~7.7，排空尿液，沖洗膀胱，誘導(dǎo)排精， 取膀胱內(nèi)容物，離心

5、濃縮至1ml立即進行人工 授精 精液量及精子少的患者：多采集幾次濃縮后進行人工授精精液不液化：授精前加糜蛋白酶或胰蛋白酶使之液化精子活力差：加入咖啡因，終濃度為7.2mmol/L, 提高精子活 力，提高精子受精能力。,（二）人工授精的方法1、子宮人工授精①宮腔內(nèi)授精：處理過的精子直接送入宮腔②宮頸內(nèi)授精：將精液注入宮頸內(nèi)③陰道內(nèi)

6、授精：將精液注入子宮頸周圍 將宮頸蓋上宮頸杯，將精液注入杯中，杯留 放24小時2、輸卵管內(nèi)精液灌注原理：封閉子宮頸口后，向?qū)m腔內(nèi)注入4ml處理過精子懸液，利用子宮腔壓力，使輸卵管內(nèi)口張開，精液進入輸卵管。,第二節(jié)：試管嬰兒的培育方法第一代試管嬰兒：體外受精-胚胎移植術(shù) 1978 英國

7、 1988 中國 第二代試管嬰兒：單精子卵細胞漿內(nèi)顯微注射授精技術(shù) 1992 比利時 1996 中國 第三代試管嬰兒：胚胎種植前的遺傳學(xué)診斷 1990 1999 中國第四代試管嬰兒：核移植技術(shù) 1997 英國 2002年 中國,一、常規(guī)試管嬰兒培養(yǎng)技術(shù)——第一

8、代試管嬰兒 體外授精-胚胎移植術(shù)：體外讓卵子與精子結(jié)合形成受精卵，在體外繼續(xù)培養(yǎng)8細胞左右，再將胚胎重新移植到母親子宮中，繼續(xù)發(fā)育生長直至足月分娩。主要解決女性因素的不育。適應(yīng)癥：① 雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞，估計治療效果差或經(jīng)治療無效者；② 行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③ 不明原因不孕者；④ 需要贈卵，并有受孕的其它基本條件者。,一、常規(guī)試管嬰兒培養(yǎng)技術(shù)——第一代試管嬰兒 體外授精-胚胎移植術(shù)：體外讓

9、卵子與精子結(jié)合形成受精卵，在體外繼續(xù)培養(yǎng)8細胞左右，再將胚胎重新移植到母親子宮中，繼續(xù)發(fā)育生長直至足月分娩。主要解決女性因素的不育。（一）主要適應(yīng)癥和禁忌癥：適應(yīng)癥：① 輸卵管病變所致不孕：雙側(cè)輸卵管缺如或完全阻塞；② 行宮腔內(nèi)人工授精3-6次未受孕者；③ 不明原因不孕者；④ 子宮內(nèi)膜異位癥不孕；,適應(yīng)癥：⑤ 無排卵或黃素化卵泡未破裂綜合征；⑥ 子宮頸病變，阻礙精子進入；⑦ 一方生殖細胞缺如；⑧ 子宮發(fā)育異?；蛉比?/p>

10、； ⑨選擇性生育。禁忌癥：① 年齡：40歲以上不適于IVF；② 過度肥胖者；③ 高催乳素血癥造成的不孕；④ 嚴(yán)重的盆腔粘連者。,（二）卵子的收集1、獲得可受精卵的方法① 自然周期法：② 藥物誘發(fā)超數(shù)排卵法：③ 誘發(fā)排卵常用藥物及其作用機制克羅米酚、人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）、FSH2、采卵的方法① 腹腔鏡手術(shù)取卵② 超聲波導(dǎo)向采卵,3、卵子成熟度的判定 從理論上講，成熟

11、的卵母細胞在排卵前已完成第一次成熟分裂，第一極體的排出是卵成熟的標(biāo)志。經(jīng)驗性評估卵母細胞成熟度的方法① 根據(jù)卵丘細胞的伸展度② 依據(jù)卵泡的大?、?根據(jù)卵丘細胞內(nèi)脂肪顆粒多少④ 根據(jù)卵-放射冠-卵丘復(fù)合體的特點 成熟型：直徑3~5mm或更大，卵丘細胞之間距離大，放 射冠分散，透明帶可見。 未成熟型：直徑1~1.5mm，緊密放射冠，看不清透明帶,成熟的卵母細胞,未成熟

12、卵母細胞,,（三）精子的準(zhǔn)備1、精液的采集與人工授精相同2、精液分析 形態(tài)、細菌、免疫、細胞遺傳學(xué)關(guān)于精子受精能力的評價：① 保持直線性向前運動能力的精子受精能力強② 正常精子多而畸形精子少，受精能力強穿卵實驗陽性，受精能力強3、精液的加工處理 目的：洗滌精子、去除精漿、增強精子活力、精子獲能,穿卵實驗陽性,,,（四）體外授精及體外培養(yǎng)1、孵育卵細胞：使卵母細胞在體外進一步成熟2、檢查精子活力，調(diào)

13、節(jié)精子濃度3、人工授精：向孵育好的卵細胞中加入適量精子 5~10萬4、換液培養(yǎng)：人工受精后14~16h觀察，如出現(xiàn)雌、雄原核，卵周隙有第二極體，表明受精成功，隨后將受精卵轉(zhuǎn)移到生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，使其卵裂并發(fā)育，以便適時施行胚胎移植。,（五）胚胎移植與妊娠監(jiān)護 ET是試管嬰兒試驗中的最后一步，也是最重要一關(guān)1、胚胎的移植：2~16細胞（卵裂球）時移植；2~4胚胎/次2、妊娠監(jiān)護：放射免疫方法檢測血、尿中hCG

14、 6天：血中hCG升高，8天：尿中hCG升高 3周：超聲檢查胚囊位置，5周：胚胎大小和胎心波動3、影響ET的因素：① 移植時，母體子宮內(nèi)膜與胚泡發(fā)育不同步；② 穿刺取卵時黃體受損，使黃體功能不足；③ 移植過程中，胚泡損傷或子宮內(nèi)膜損傷,,4、提高受精率，卵裂率，早期胚胎率 關(guān)鍵在于不斷提高體外配子及胚胎培養(yǎng)技術(shù) 共培養(yǎng)技術(shù)提高受精卵、胚胎質(zhì)量及妊娠率。 共培養(yǎng)：指卵子和

15、精子體外受精后，置于一定濃度共培養(yǎng)細 胞的條件培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。共培養(yǎng)細胞：自體細胞或異體細胞 子宮內(nèi)膜細胞、顆粒細胞、輸卵管上皮細胞,,（六）“試管嬰兒”的成功率 1、成功率：體外受精率：85%~90% 卵裂率（體外培養(yǎng)成功率）：80% 胚胎移植后妊

16、娠率：20%~25%2、畸形發(fā)生率：1987~1991年總計出生6248例試管嬰兒，有 某種畸形的新生兒187例，占總數(shù)的2.8%。 這與自然妊娠分娩的新生兒畸形發(fā)生率相當(dāng)。,二、顯微授精——第二代試管嬰兒 主要目標(biāo)：幫助精子穿過透明帶 顯微授精技術(shù)

17、 透明帶鉆孔技術(shù)（PZD） 透明帶下授精（SUZI） 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI） 針對男性少、弱、畸精癥或阻塞性無精癥,（一）顯微授精技術(shù)發(fā)展簡史,1962年 Hiramoto 首次將海膽精子直接注入海膽卵中1966年Graham將青蛙精子注入未受精的蛙卵中，PN 形成1988年第一個通過精子微注射受精的子代動物（小鼠）誕生1988年lan

18、zendorf等人首次報道人精子直接注入卵胞漿中PN形成1992年P(guān)alermo等人報道卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）嬰兒誕生1996年我國首例ICSI在中山醫(yī)科大學(xué)獲得成功（莊廣倫）,（二）Intracytoplasmic Sperm Injection(ICSI),定義：指用顯微操作術(shù)將單個精子注入卵胞漿的過程適應(yīng)癥：① 嚴(yán)重精子質(zhì)量異常 ② 既往常規(guī)IVF失敗患者

19、 ③ 嚴(yán)重的抗精子抗體患者 ④ 無精子癥患者 ⑤ 未成熟卵以及冷凍保存的卵母細胞 ⑥ 常規(guī)IVF失敗未受精卵母細胞,ICSI操作程序,促排卵和卵子的采集卵子體外培養(yǎng)精子的采集及處理顯微注射 ① 精子制動 ② 卵胞漿內(nèi)精子注入 ③ 放開卵母細胞

20、，培養(yǎng)16~24 h 4~8-細胞或囊胚后，移植母體子宮中,影響ICSI 成功的主要因素,ICSI 成功與否主要看受精、卵裂及妊娠率，除技術(shù)因素外，徑自、卵子狀態(tài)及卵子激活等都直接影響其成功。 ① 顯微操作技術(shù)對ICSI 的影響 體外操作過程不超過5分鐘 注射針內(nèi)徑5~8微米之間 固定針外徑120微米，內(nèi)徑15~40微米 ② 精子狀態(tài)對

21、ICSI的影響,影響ICSI 成功的主要因素,③ 卵子對ICSI的影響 卵子狀態(tài) 卵母細胞成熟程度 女性年齡影響卵子質(zhì)量 卵子激活 以放出第二極體、形成雌雄原核為標(biāo)志并最終啟動卵子代謝的一系列變化,,,ICSI的風(fēng)險與出生缺陷,與ICSI操作無關(guān) 卵巢過度刺激綜合征、多胎妊娠、異位妊娠與ICSI操作有關(guān) 基因

22、缺陷垂直傳播 外源DNA污染,三、細胞核移植技術(shù)----第四代試管嬰兒,（一）、概論什么是克隆？　“clone”：單性生殖，本意是指通過無性形式　　由單個細胞產(chǎn)生的和親代非常相似的后代。 動物克隆：指一個動物經(jīng)無性繁殖或孤雌生殖而產(chǎn)生的 多個后代，克隆的所有成員遺傳物質(zhì)完全相同。,人有無自然單性生殖？,古代傳說：軒轅黃帝之母“感電光繞頭而有娠”，生黃帝1955年，Spuwary,相信人類有單性生殖至今尚無一例

23、經(jīng)得起嚴(yán)格的科學(xué)檢驗生物進化證明：有性生殖是從無性生殖發(fā)展而來，刻意對人進行無性生殖意味著退化！,細胞核移植,是指將發(fā)育不同時期的胚胎或成體細胞核經(jīng)顯微手術(shù)和細胞融合方法移植到去核卵母細胞中，或?qū)Ⅲw細胞核直接注入去核卵母細胞中，重新組成胚胎并使之發(fā)育成子代個體?？寺〖夹g(shù)之所以引人關(guān)注，是因為它在醫(yī)療和畜牧業(yè)方面有深遠意義,克隆研究大事記,1938年，德國科學(xué)家Spemann首次提出動物細胞克隆設(shè)想1952年，美國學(xué)者Briggs

24、和King首先在青蛙身上進行克隆實驗1970年，克隆青蛙取得突破進展1981年，胚胎克隆鼠成功1984年， 胚胎克隆羊成功,克隆研究大事記,1994年，用發(fā)育120個細胞階段的胚胎細胞核移植成功，獲得克隆牛1997年，英國Wilmut體細胞克隆羊成功 “多莉”1998年，英國PPL醫(yī)療公司，克隆牛“弗遜先生”1998年，克隆鼠克隆出克隆鼠1999年，美國克隆第一只雄性鼠2000年，美國牛耳皮細胞克隆6頭牛2001年，美

25、國克隆出第一個靈長類動物恒河猴,二、哺乳動物細胞核移植方法,（一）重構(gòu)卵的形成1、供體細胞和受體細胞的選擇和處理 供體細胞：即細胞核的來源 早期胚胎細胞、干細胞、體細胞 受體細胞：提供去除核后的只含有細胞質(zhì)的 細胞 MII期卵母細胞、受精卵、融合后2細胞胚,,,2、細胞核移植 包括受體細胞核去除和供體細胞核移入,受體細胞核的去除移核

26、 帶下移植 胞質(zhì)內(nèi)注射,,,細胞融合,融合方法：化學(xué)融合、病毒融合、電融合 電融合：通過外加脈沖電場來改變細胞膜通透性，從而促進膜內(nèi)外物質(zhì)交換，當(dāng)細胞膜緊密接觸時，電擊可以使接觸膜上形成孔洞，導(dǎo)致細胞融合。融合液：0.27mol/L蔗糖液、甘露醇溶液電融合方法,（二）重構(gòu)卵的活化處理,一般電融合完成后，卵子因電刺激而被激活，但也有的核移植重構(gòu)卵還需進一步充分激活才能發(fā)育。應(yīng)用較多的化學(xué)

27、激活劑有7%乙醇、離子霉素、星形孢菌素等,（三）移核胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植,與IVF-ET相同體外培養(yǎng)一段時間觀察發(fā)育能力將胚胎輸入輸卵管或子宮克隆動物誕生,（四）影響核移植的一些因素,受體因素 卵母細胞胞漿 卵母細胞活化時間 卵母細胞年齡：不成熟或老化 卵母細胞去核時去掉胞漿的多少,四）影響核移植的一些因素,供體因素：供體核是克隆的主體，而受體無核胞漿只是提供發(fā)育的一個環(huán)境，因此供體細胞是影響核移

28、植胚發(fā)育的更關(guān)鍵因素。供體細胞的種類、分化程度和其所處細胞周期均影響核移植胚發(fā)育。,（五）提高核移植成功率的方法,選用MII期卵母細胞，在移植操作完成之后，避免或減少對卵母細胞的刺激，防止過早活化。在操作完成一段時間后再用適當(dāng)?shù)拇碳な孤涯讣毎罨?。供體細胞選擇分化程度低的胚胎細胞和胎兒細胞并且處于G1或Go 期細胞，克隆成功率較高。,（六）核移植實驗結(jié)果的檢測,為了保證核移植實驗結(jié)果的可靠性，有必要對實驗結(jié)果進行驗證性檢驗。毛

29、色等在內(nèi)的表型特征遺傳標(biāo)記檢測特有基因測定,（七）核移植的意義與應(yīng)用前景,核移植技術(shù)在商業(yè)上的應(yīng)用之一是胚胎克隆，從理論上講，胚胎克隆可以繁殖在遺傳上完全一致的優(yōu)良種群，使優(yōu)良基因和優(yōu)良基因組合得到穩(wěn)定的延續(xù)和保存。為瀕危動物的保護提供新的方法。核移植技術(shù)為不能正常生育而希望有自己遺傳后代的夫婦提供生育可能。,（八）克隆人的倫理問題,將克隆胚胎冷凍，將來克隆出人后摘除器官用于已出生的孿生兄弟姐妹的器官移植。 這些做法明顯貶低

30、了胚胎和人權(quán)的價值，是一種有悖倫理的犯罪行為。 克隆人在家庭中的角色無法確定？,（九）輔助生殖技術(shù)的倫理問題,供精受精，主要解決男性不育 誰是父親？IVF-ET, 捐贈卵和胚胎 誰是父母？,客觀評說,克隆養(yǎng)的出現(xiàn)引起克隆人的恐慌，但事實提示：克隆人遲早是要問世的。就像過去生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域重組DNA和試管嬰兒的問世所經(jīng)歷的，從恐慌、非議到認(rèn)可、推廣的過程那樣，只要克隆生育能真正造福人類。,代孕母親的倫理問題,生育過程