化學(xué)發(fā)光法的原理技術(shù)要點及評價應(yīng)用

1、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù),第一節(jié) 發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA)（chemiluminescence immunoassay） 第四章 電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay),化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：集靈敏的化學(xué) 發(fā)

2、光分析和特異的抗原抗體免疫測 定于一體的檢測技術(shù)。,概 念,特點： 特異性高、敏感性高、分離簡便、 快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、 可自動化。,化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型,按發(fā)光劑不同分為 1.發(fā)光酶免疫測定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.電化學(xué)發(fā)光

3、免疫測定技術(shù)(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分離方法不同分 1.微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測定 2.磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定,第一節(jié) 發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑,一、發(fā)光 一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時， 釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。,1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經(jīng)短波長入射光照射后進入激 發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。,2.生物發(fā)光:反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用

4、ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回 復(fù)到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。,3.化學(xué)發(fā)光:在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。 化學(xué)發(fā)光是一個多步驟的過程。,,熒光素酶ATP；O2；Mg2+,,,氧化螢火蟲熒光素,螢火蟲熒光素,生物發(fā)光,返回,,,,,,,光 + AMP+ O2 + CO2 +,化學(xué)發(fā)光,機制：某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能 量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子 激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分

5、子衰退至基 態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。,二、化學(xué)發(fā)光劑,化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參 與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量 的化合物。 發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑,①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)； ②與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑； ③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力； ④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性， 特別是免疫活性。,化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個條件,返回,1.酶

6、促反應(yīng)的發(fā)光底物,是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸 AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物） 特點：可作標(biāo)記物、也可作過氧化物酶的底物,1.1 魯米諾,H2O2 /OH — HRP,,,,,,,,,,,,+N2 + H2O +光,對-羥基苯乙酸（HPA）,HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光 物質(zhì)），

7、在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長 的熒光，可用熒光光度計測量。,1.2 HPA,H2O2HRP,,,,,,,,,,,+熒 光,,氧化二聚體,AMPPD,AMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的 AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā) 出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度 達(dá)到高峰，15～60min內(nèi)光強度保持相對穩(wěn)定。,,,,,,,,,,,,光,AP /OH —

8、 HPO4 2—,,1.3 AMPPD,4-MUP,4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的 激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒 光光度計進行測量。,,,,,,,,,,,,熒光,AP,1.4 4-MUP,4-MU,360nm激發(fā)光,,H3PO4 +,2.直接化學(xué)發(fā)光劑,特點：不需催化劑，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件 就能發(fā)光的物質(zhì)。反應(yīng)迅速、背景低、 信比高，發(fā)光量

9、與AE濃度呈線性關(guān)系。 常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）,+ CO2+ 光,,3.電化學(xué)發(fā)光劑,是指通過在電極表面進行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出 光的物質(zhì)。特點：①反應(yīng)在電極進行； ②電子供體為：三丙胺（TPA） ③化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕,返回,三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖,第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）,一、原理 屬于酶免疫測定的一種。只是最后一 步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)

10、 發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。,二、技術(shù)類型 根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為： 1.熒光酶免疫測定技術(shù) 2.化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù),根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分 1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法 3.固相抗原競爭法：,熒光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖,洗滌棄上清,,,,,是利用理想的酶熒光底物，生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有 強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。,化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù)反應(yīng)原理圖,洗滌棄上清,,,,,

11、是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光， 通過光強度的測定而直接進行定量。,電化學(xué)發(fā)光原理圖,這一過程可在電極表面周而復(fù)始地進行 產(chǎn)生許多光子，使光信號增強,返回,激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,基態(tài),電極,1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 將已包被了抗體的乳膠微 粒和待測標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育一定時間 后,再加入AP標(biāo)記抗體，溫育,形成固相包被抗 體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,技術(shù)要點,2.分離技術(shù) 將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上，用緩 沖液

12、洗滌，沒結(jié)合的抗原被洗脫，酶標(biāo)抗體-抗 原-膠乳微?？贵w復(fù)合物則被保留在纖維膜上。,3.酶促發(fā)光反應(yīng) 加入4-MUP，酶標(biāo)抗體上AP將 4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照 射下，發(fā)出448nm的熒光，經(jīng)熒光儀記錄，放大， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計算出所測物質(zhì)的含量,1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標(biāo) 本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過 一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后,最終通過磁場將結(jié)合

13、 酶標(biāo)記物IC和游離酶標(biāo)記物進行分離的技術(shù)。,分離技術(shù),2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為 抗體或抗原的包被載體, 然后用纖維膜柱子進 行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。,3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在 小珠上包被抗原或抗體,經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后,將 結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進行分離.,第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（CLIA）,一、原理 用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體,與 待測標(biāo)

14、本中相應(yīng)Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反 應(yīng)，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離 狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開來，然后加入 發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應(yīng)，通過對發(fā)光強度的 檢測進行定量或定性檢測 。,二、技術(shù)類型 1.分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù) 2.免疫學(xué)反應(yīng)模式 同酶發(fā)光免疫測定技術(shù) 3.不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶,1.抗原抗體結(jié)合反應(yīng) 將包被McAb的磁顆粒和待 測標(biāo)本加入到反應(yīng)管中

15、，標(biāo)本中待測Ag與磁珠 上Ab結(jié)合，再加上AE標(biāo)記Ab，經(jīng)過溫育，形成 磁珠Ab-Ag-AE標(biāo)記Ab復(fù)合物。,技術(shù)要點,2.分離技術(shù) 在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快 地將未結(jié)合的多余Ag和標(biāo)記Ab洗去。,3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 經(jīng)洗滌的磁珠中，加入H2O2和 pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并 發(fā)光，由集光器接收，經(jīng)光電倍增管放大，記 錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，其積分與被測物含量 成正比，按標(biāo)準(zhǔn)曲

16、線，儀器可計算出被測物含量。,1.AE其低背景噪音、化學(xué)反應(yīng)簡單、快速而無催 化劑。,方法評價,2.AE與大分子的結(jié)合并無減少所產(chǎn)生的光量， 從而增加靈敏度，靈敏度可達(dá)10-15g/ml。,3.AE標(biāo)記試劑有效期長，可達(dá)一年。,4.固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉，除增大包被 面積，加快反應(yīng)外，亦同時使清洗及分離更 簡易、快捷。,第四節(jié) 電化學(xué)發(fā)光免疫測定技術(shù)（ECLI）,一、原理 是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特

17、異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實際上包括了電化學(xué)和化 學(xué)發(fā)光二個過程。ECL是電啟動發(fā)光反應(yīng)，而CL 是通過化合物混合啟動發(fā)光反應(yīng)。用化學(xué)發(fā)光 劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab 反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極 上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。,二、技術(shù)類型 1.分離方法 常用磁顆粒分離技術(shù) 2.免疫學(xué)反應(yīng)模式 同酶發(fā)光免疫測定技術(shù) 3.相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶

18、釕而不是酶,1.三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測標(biāo)本 同時加入一個反應(yīng)杯中孵育反應(yīng),技術(shù)要點,2.將鏈霉親和素（SA）包被磁珠加入反應(yīng)杯中，再次 孵育，使生物素（B）通過與親和素（A）的結(jié)合， 將磁珠、Ab連接為一體，形成雙Ab夾心法。,3.蠕動泵將形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠 復(fù)合體吸入流動測量室，磁珠被工作電極下面的磁鐵 吸附于電極表面。同時，游離的Ab也被

19、吸出測量室。,4.蠕動泵加入TPA，電極加電壓，啟動ECL反應(yīng)過程。 該過程在電極表面周而復(fù)始地進行，產(chǎn)生許多光子， 光電倍增管檢測光強度，其與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈 線性關(guān)系,故可測出待測Ag的含量。,原理圖,返回,抗體包被 樣本 Ru(byp)2+ TPA緩沖的磁珠 抗原 標(biāo)記抗體

20、 液洗滌,3,方法評價,①標(biāo)記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強 度更高、易于測定；②敏感度高，可達(dá)pg／ml或pmol水平；③線性范圍寬＞104；④反應(yīng)時間短，20min以內(nèi)可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。,五、臨床應(yīng)用,1.甲狀腺激素 2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素 4.貧血因子5.腫瘤標(biāo)記物 6.感染