化學發(fā)光原理

1、簡介上世紀70年代中期Arakawe首先報道CLIA，發(fā)展至今已經成為一種成熟的、先進的超微量活性物質檢測技術，應用范圍廣泛，近10年發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數量級，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（618個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點。高

2、靈敏度的化學發(fā)光檢測技術以被廣大研究人員所認可，并正逐漸替代傳統的生物檢測技術。化學發(fā)光與放射免疫法是公認的腫瘤標志物和各種激素最精確和最成熟的檢測方法，二者的原理、技術與方法早已成熟并被國外各大醫(yī)院用于腫瘤檢測和激素檢測，二者的試劑與儀器均通過美國FDA認證與我國藥監(jiān)局的批準。但是，放射免疫分析法雖有很高的靈敏度，卻存在放射性防護和同位素污染的問題，況且試劑價格昂貴只有一個有保質期，在基層醫(yī)療機構難以普及?；瘜W放光免疫分析儀繼承了放射

3、免疫的所有優(yōu)點，同時克服了放射免疫和酶聯免疫各自的缺點，是臨床免疫檢測最理想的新方法?？梢钥隙ǖ恼f，她將取代放射免疫和酶聯免疫成為臨床免疫檢測最理想的新技術。[1]2原理化學發(fā)光免疫分析包含兩個部分即免疫反應系統和化學發(fā)光分析系統?；瘜W發(fā)光分析系統是利用化學發(fā)光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化形成一個激發(fā)態(tài)的中間體當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時同時發(fā)射出光子(hM)利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產額。免疫反應系統是將發(fā)光物質(在反應

4、劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標記在抗原(化學發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學發(fā)光分析)上或酶作用于發(fā)光底物。3類型化學發(fā)光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種:(1)化學發(fā)光標記免疫分析法(2)酶標記、以化學發(fā)光底物作信號試劑的化學發(fā)光酶免疫分析法化學發(fā)光標記免疫分析化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析(CLIA)是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物——acridiniumeste

5、r(AE)是有效的發(fā)光標記物[3]其通過起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用而酮以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。ALP標記的CLEIA所用底物為環(huán)122二氧乙烷衍生物這是一類很有前途的發(fā)光底物用于化學發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩(wěn)定作用的基團——金剛烷基其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。最常使用的底物是AMPPD[32(2’2spiroadaman2tane)42me

6、thoxy242(3’2phosphoryloxy)2phenyl2122dioxetane]中文名為:32(2’2螺金剛烷)242甲氧基242(3’2磷酰氧基)2苯基2122環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(ALP)作用下磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基得到一個中等穩(wěn)定的中間體AMPD(半壽期為2～30min)此中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子當其回到基態(tài)時產生470nm的光可持續(xù)幾十分鐘

7、(如圖5)。AMPPD為磷酸酯酶的直接化學發(fā)光底物可用來檢測堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物?？蓹z測到堿性磷酸酯酶的濃度為1015molL。美國DPC公司的Immulite全自動酶放大發(fā)光免疫分析儀以堿性磷酸酶為標記物以金剛烷作發(fā)光底物測定靈敏度相當于1021molmL的酶采用聚苯乙烯珠作載體其檢測水平已能達到1012gmL?；瘜W發(fā)光免疫分析儀是通過檢測患者血清從而對人體進行免疫分析的醫(yī)學檢驗儀器。將定量的患者血清和辣

8、根過氧化物（HRP）加入到固相包被有抗體的白色不透明微孔板中，血清中的待測分子與辣根過氧化物酶的結合物和固相載體上的抗體特異性結合。分離洗滌未反應的游離成分。然后，加入魯米諾Luminol發(fā)光底液，利用化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放。此時，將微孔板置入分析儀內，通過儀器內部的三維傳動系統，依次由光子計數器讀出各孔的光子數。樣品中的待測分子濃度根據標準品建立的數學模型進行定量分析。最后，打印數據報告

9、，以輔助臨床診斷。化學發(fā)光免疫分析技術概要一前言化學發(fā)光(chemiluminescence)是指某些化學反應中發(fā)出可見光現象。最早發(fā)現的化學發(fā)光現象發(fā)生在生物體內，發(fā)光生物體廣泛存在于自然界，大約有13大類近千種。1902年Schmitz最早合成的魯米諾發(fā)光試劑被廣泛用于血跡鑒定工作。國外化學發(fā)光分析方面的研究在20世紀六七十年代得到迅速發(fā)展，直到現在，化學發(fā)光分析的研究和應用仍然是痕量分析領域的一個十分重要的研究方向。我國的化學發(fā)光

10、研究工作起步比較晚，到20世紀70年代后期才有介紹文章，80年代才有原始性的研究報道。在過去的20多年中，我國的化學發(fā)光從無到有，從小到大，從國內走向國際，2004年9月第十一屆發(fā)光光譜分析國際會議在北京召開，標志著我國的化學發(fā)光研究走上了一個新的臺階。隨著光電轉換技術的提高和計算機的普及和使用，化學發(fā)光儀器性能獲得空前的提高，化學發(fā)光的研究和應用得到快速的發(fā)展，特別是在臨床檢驗和環(huán)境檢測方面已經成為不可缺少的分析方法?；瘜W發(fā)光檢測技術