菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程,操作規(guī)程

1、1菌種管理制度菌種管理制度1、目的建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2、適用范圍本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義?標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。?傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代

2、及制備工作用菌種。?工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。?菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4、職責(zé)4.1部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2微生物檢驗員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1菌種的申購部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計劃（包括臨時檢驗需要），填寫申購流程，經(jīng)審批后，

3、向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或傳代用菌種，購買時，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2菌種的接收菌種到達(dá)實驗室后，由部門主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在《標(biāo)準(zhǔn)菌株庫存記錄》上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于4～8℃冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3菌種的保存5.3.1工作

4、用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至4～8℃冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時間根據(jù)菌種種類35.4.1.1.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培養(yǎng)基?改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；?液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)

5、壯；?營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；?改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a)在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b)用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時必須小心，因為安瓿遇熱時可能會破裂）。c)以無菌方法用一無菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體

6、培養(yǎng)基中移取0.5～0.8ml到安瓿中。d)輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e)用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。f)根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)18～24小時；真菌培養(yǎng)溫度23～28℃，培養(yǎng)3～5天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)蘇生長；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至7天，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。g)若黑曲霉為菌懸

7、液，則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體1～2滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23～28℃培養(yǎng)5～7天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有0.05%（mlml）的吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h)取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液810ml至液體培養(yǎng)基中按f）項操作對菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，

8、1~2ml管，分裝于凍存管。每個菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)，其余作為儲備管在30℃冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種菌懸液中1~2ml管加石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于20℃冷凍或2～8℃冰箱中保存。制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)