生物分離工程實(shí)驗(yàn)講義(生工09)

1、桂林理工大學(xué)生物工程專業(yè)桂林理工大學(xué)生物工程專業(yè)《生物分離工程生物分離工程》實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)講義1實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一牛乳中酪蛋白的提取牛乳中酪蛋白的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握等電點(diǎn)法提取蛋白的基本原理及基本操作；2、掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白含量的基本原理及基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理酪蛋白是乳蛋白質(zhì)中最豐富的一類蛋白質(zhì)，約占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是單一的蛋白質(zhì)，是一類含磷的復(fù)合蛋白質(zhì)混合物，以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相

2、結(jié)合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35gL，比較穩(wěn)定，利用這一性質(zhì)，可以檢測(cè)牛乳中是否摻假。酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)由于靜電荷為零，同種電荷間的排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，經(jīng)牛乳調(diào)到pH4.6，酪蛋白就從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被利用來從酪蛋白粗制劑中將脂類雜質(zhì)除去。在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一個(gè)常需測(cè)定的指標(biāo)。常用于測(cè)定酪蛋白的方法是先將酪蛋白在等電點(diǎn)沉淀

3、，再用凱氏定氮法測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲法測(cè)定酪蛋白。其原理為：蛋白質(zhì)含肽鍵，肽鍵在堿性溶液中可與銅離子形成紫紅色化合物，在540nm波長處有最大吸收，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸組成無關(guān)。三、材料與試劑三、材料與試劑市售牛奶10mgmL酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（用0.1MNaOH配制）0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc－NaAc緩沖液雙縮脲試劑：稱取硫酸銅（CuSO45H2O）1.5g，加水100mL，加熱

4、助溶；另稱取酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O64H2O）6.0g、碘化鉀5g溶于500mL水中。兩液混勻后，在攪拌下加入10%NaOH300mL，后用水稀釋至1000mL，貯存于塑料瓶中。此液可長期保存，若瓶底出現(xiàn)黑色沉淀則需重新配制。四、操作步驟四、操作步驟1、牛乳中酪蛋白的等電點(diǎn)沉淀、牛乳中酪蛋白的等電點(diǎn)沉淀用量筒量取25mL牛乳兩份分別置于50mL燒杯中，水浴加熱至40℃，在攪拌下慢慢加入到已預(yù)熱至40℃的等體積的0.2MpH4.6的

5、HAc－NaAc緩沖液中，混勻，冷卻靜置30min沉淀酪蛋白后，3000rmin離心15min，棄上清液，收集沉淀。一份沉淀用于“除雜”步驟，另一份沉淀用0.1MNaOH溶液溶解并定容至100mL，用于“酪蛋白含量測(cè)定”步驟。2、除雜、除雜將上述沉淀搗碎，加入10mL95%乙醇，攪拌制成懸浮液。將此懸浮液傾于布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再用10mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗滌沉淀兩次，最后再用10mL乙醚洗滌沉淀兩次，桂林理工大學(xué)生

6、物工程專業(yè)桂林理工大學(xué)生物工程專業(yè)《生物分離工程生物分離工程》實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)講義3實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二大蒜細(xì)胞大蒜細(xì)胞SOD酶的提取與分離酶的提取與分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握SOD酶的提取、分離、檢測(cè)等一般步驟；2、掌握酶在提取過程中的兩個(gè)重要參數(shù)：回收率和純化倍數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理超氧化物歧化酶（SOD）是一種就有抗氧化，抗衰老，抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負(fù)離子（O）進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫：2O2H2→O

7、2H2O2.大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過組合組織或者細(xì)胞破碎后，可用PH7.8的磷酸緩沖液體提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮將其沉淀析出。鄰苯三酚在堿性條件下可迅速自氧化釋放出O2生成帶色的中間產(chǎn)物在325nm有最大吸收峰。鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物在40s3min這段時(shí)間，生成物與時(shí)間有較好的線性關(guān)系。顏色深→SOD逐漸增多→顏色淺，即酶活力越大，顏色越淺。三、試劑和材料三、試劑和材料新鮮蒜瓣，市售磷

8、酸緩沖液：0.05molL，pH7.8氯仿一乙醇混合溶劑：氯仿﹕無水乙醇=3﹕5（VV）丙酮：用前冷卻至4～10℃0.1molLTris—HCl緩沖液（pH=8.2內(nèi)含2mmolLEDTA）10mmolLHCl45mmolL鄰苯三酚（內(nèi)含10mmolLHCl）四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1、組織或細(xì)胞破碎稱取5g左右大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨，使組織或細(xì)胞破碎。2、SOD的提取將上述破碎的組織或細(xì)胞，加入2～3倍體積（1015mL）的0.05