原位雜交技術(shù)的操作詳解及小貼士

1、原位雜交技術(shù)的操作詳解及小貼士原位雜交技術(shù)應(yīng)用于染色體、細胞和組織切片等樣品中進行核酸特異性檢測，與免疫組化技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用，能將DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性與樣品的顯微拓撲信息結(jié)合起來。1969年P(guān)ardue和Gall將放射性標記的探針直接應(yīng)用于純化核酸的雜交，此后得益于分子克隆技術(shù)的發(fā)展，及不同探針標記系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)的應(yīng)用，大大增加了原位雜交檢測的應(yīng)用靈活性和檢測靈敏度。多種探針標記檢測系統(tǒng)基于地高辛、生物素和熒光標記分子的

2、標記和檢測系統(tǒng)是常見的原位雜交檢測方法。熒光標記檢測常為直接探針標記方法，如在dUTPUTPddUTP上連接Fluescein后進行核酸標記。由于標記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過程中的考驗，以及熒光分子易于衰減，其檢測靈敏度受到一定的影響。但對熒光分子的直接檢測呈現(xiàn)的背景較低。間接標記的方法中應(yīng)用了報告分子標記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高辛，生物素。結(jié)合地高辛抗體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進

3、行間接的底物反應(yīng)檢測。地高辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高辛抗體不會結(jié)合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統(tǒng)的優(yōu)勢。地高辛抗體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據(jù)不同的應(yīng)用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結(jié)果。但需注意，由于引入了免疫檢測反應(yīng)，在放大檢測靈敏度的同時，應(yīng)注意樣品內(nèi)源性酶的滅活，以降低檢測背景。切片的原位雜交，為了在實驗過程中不丟失組織樣品，

4、可使用多聚賴氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態(tài)學(xué)。樣品固定是原位雜交中必不可少的步驟，從化學(xué)反應(yīng)角度來看，固定劑的使用和選擇對后續(xù)雜交的影響不會太大，因為核酸雜交的功能分子基團被安全地包裹在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，而交聯(lián)劑的使用對RNA基本沒有影響。對于染色體涂片，常使用甲醇醋酸溶液固定；石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定。冷凍切片可通過在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。2.樣品預(yù)處理在

5、待測樣品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹纏繞，根據(jù)不同的細胞和組織樣品的應(yīng)用，可選擇合適的預(yù)處理方法將靶核酸暴露：內(nèi)源性酶滅活：如果探針的檢測是通過酶促法進行的，則樣品內(nèi)相應(yīng)的內(nèi)源性酶必須被滅活。如內(nèi)源性的POD可通過含1%H2O2的甲醛溶液處理30min。如果檢測酶為AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP檢測的內(nèi)源性背景一般來說比POD檢測的低得多，因為在雜交過程中，樣品中內(nèi)源性AP酶的活性基本都喪失了。RNase處理：在DNAD