王鏡巖生物化學(xué)名詞解釋(打印版)

1、氨基酸的紙層析法分離氨基酸的紙層析法分離目的和要求掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)(包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量)。學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及鑒定)分析的方法。原理層析法又叫色層分離法、色譜分析法或色譜法。1903年俄國化學(xué)家茨維特(HBeT)發(fā)現(xiàn)用揮發(fā)油沖洗菊粉柱時(shí)，各種顏色的色素在吸附柱上從上到下排列成色譜，故稱“色層分離法”。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構(gòu)體，顯示了這一分

2、離技術(shù)的高度分辯力，從此引起了人們的廣泛注意。自1944年應(yīng)用濾紙作為固定支持物的“紙層析”誕生以來，層析技術(shù)的發(fā)展越來越快，五十年代開始，相繼出現(xiàn)了氣相色譜和高壓液相層析，其它如薄層層析、親合層析、凝膠層析等也迅猛發(fā)展。層析分離技術(shù)操作簡便，樣品用量可大可小，既可用于實(shí)驗(yàn)室分離分析，又適用于工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)品的分析制備。現(xiàn)已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程等學(xué)科廣泛應(yīng)用而又必不可少的分析工具之一。根據(jù)所用的支持物及其理化性質(zhì)不同可將層析

3、法分成三類：1.用固體吸附劑做支持物的稱吸附層析；2.用吸附了某種溶劑的固體物質(zhì)(如濾紙)做支持物的稱為分配層析；3.用其表面所含離子能與溶液中的離子進(jìn)行交換的固體物質(zhì)做支持物的稱為離子交換層析。紙層析所依據(jù)的原理是分配層析，故屬于分配層析的范疇。一、分配層析分配層析法是利用不同的物質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的溶劑中的分配情況不同而使之得到分離的方法。將分配層析法中的一種溶劑設(shè)法固定在一個(gè)柱內(nèi)，再用另外一種溶劑來沖洗這個(gè)固定柱，同樣可達(dá)到將不同物

4、質(zhì)分離的目的。我們把固定在柱內(nèi)的液體稱為固定相，把用作沖洗的液體叫做流動(dòng)相。為了使固定相固定在柱內(nèi)，需要有一種固體物質(zhì)把它吸牢，這種固體物質(zhì)本身對分離不起什么作用，對溶質(zhì)也幾乎沒有吸附能力，稱為支持物。進(jìn)行分離時(shí)由于被分離物質(zhì)的組分在兩相中的分布不同，因此當(dāng)流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)，不同組分移動(dòng)的速度也不相同。易溶于流動(dòng)相中的組分移動(dòng)快，在固定相中溶解度大的組分移動(dòng)就慢，于是得到分離。分配層析法中不同溶質(zhì)的分離取決于其在兩相(固定相和流動(dòng)相)間分配

5、系數(shù)的不同，分配系數(shù)(α)的定義是：α=溶質(zhì)在固定相的濃度(CS)溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度(CL)濾紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。濾紙的成份是纖維素，纖維素的—OH基為親水性基團(tuán)，因此可吸附一層水或其它溶劑作為固定相。通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。當(dāng)將溶質(zhì)樣品(被分離使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動(dòng)較大，而中性氨基酸的Rf值變動(dòng)較小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的極性降低，從而使Rf值變大，而使堿性氨基酸的Rf變小。反之，如在正丁醇

6、中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值變小，而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。4.濾紙對Rf值的影響：濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點(diǎn)形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力的大小而異，質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴(kuò)展不一致，隨著纖維的紋理流動(dòng)紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。5.溫度對Rf值的影響：Rf值的重現(xiàn)性與恒溫情況的好壞有密切關(guān)系。溫度對Rf值

7、的影響主要是因?yàn)槿苜|(zhì)在固體相與流動(dòng)相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發(fā)能力也不同，因此有些溶劑系統(tǒng)對溫度的敏感程度強(qiáng)些，有些則差些。敏感程度強(qiáng)的對溫度的要求就嚴(yán)格，敏感程度差的對溫度的要求就不太嚴(yán)格。溫度改變使溶劑系統(tǒng)中的溶解度改變，所以Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進(jìn)行的，室溫可在20℃至40℃，溫度改變不超過0.5℃。無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法(如核苷酸類物質(zhì)用紫外光照射)或顯色法鑒定。

8、氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實(shí)驗(yàn)采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH，時(shí)間影響較大。如果要使結(jié)果重復(fù)，必須嚴(yán)格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會(huì)使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時(shí)顯色點(diǎn)上會(huì)出現(xiàn)白斑，空氣中其它的雜質(zhì)如氨，硫化氫或酚等皆會(huì)影響顯色結(jié)果。銅離子可以與氨基酸茚三酮顯色物形成絡(luò)合物，顏色較穩(wěn)定，用硫酸銅乙醇溶液洗脫層析后的顯色斑點(diǎn)，可以通過比色法定量測定氨基酸含量。由于紙上層析設(shè)備條件較簡單，

9、操作比較簡便，并可以分離微量樣品，因此紙層析方法已成為生化分析和研究的主要方法之一，廣泛應(yīng)用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、維生素以及脂肪酸等的分離鑒定。操作步驟一、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸紙上層析1.單向上行層析(1)氨基酸Rf值的測定濾紙：選用國產(chǎn)新華1號濾紙(若有較多的樣品需在紙上分離，可采用新華3號濾紙)，戴上橡皮手套，將濾紙裁剪成28cm28cm，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點(diǎn)樣處，圈直徑不超過0.5cm