孫怡群厭氧菌的實驗室檢查

1、厭氧菌的實驗室檢查,西京醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室孫怡群,,一、 厭氧菌的分布和正常菌群二 、厭氧培養(yǎng)方法簡介三 、厭氧菌鑒定方法簡介四 、厭氧菌藥敏實驗方法簡介,,一、厭氧菌的分布和正常菌群,1.什么是厭氧菌,2.根據(jù)對氧的耐受性分類,3.厭氧機(jī)理,4.厭氧菌分類的變遷和檢索,5.正常菌群中的厭氧菌,厭氧菌（ Anaerobes）是指一群在菌細(xì)胞代謝的呼吸鏈中不能以分子氧作為終末電子受體的細(xì)菌，它們以有機(jī)物或無機(jī)物作為終末電子受體

2、，必須在低Eh，并含一定濃度CO2環(huán)境中才能生長的細(xì)菌，它們的能量只能來自酵解途徑，這類細(xì)菌稱為厭氧菌。,1.什么是厭氧菌,2.根據(jù)對氧的耐受性分類,專性厭氧菌,微需氧菌,厭氧菌,絕對厭氧菌,中等厭氧菌,耐氧厭氧菌,微需氧菌,,,,,,,,,,,,,（1）專性厭氧菌,一般以有機(jī)物為終末電子受體，只有在低氧分壓（絕對無氧環(huán)境）、低氧化還原電勢（Eh）中才能生長的細(xì)菌，它包括兩大類：絕對厭氧菌：（對氧極端敏感的厭氧菌EosA)只能在0.5

3、%氧分壓下生長或暴露在空氣中10分鐘左右立即死亡的細(xì)菌，如齒垢密螺旋體（T.denticola)，月形單胞菌（Selenomonas)中等厭氧菌： 指能在2%-8%氧分壓中生長，或暴露在空氣中60-90分鐘仍能存活的厭氧菌。臨床上多見，如脆弱類桿菌（B.frgilis)、產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens)、普氏消化鏈球菌（P.prevola)以及雙歧桿菌屬中許多種都屬于此類菌。,（2）微需氧菌,在含10%左右氧分壓能生存，一般

4、只有在含5%-10% CO2條件中才能生長的細(xì)菌如彎曲菌屬（Campylobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、丙酸桿菌屬等細(xì)菌多屬于此類細(xì)菌，它包括兩大類：耐氧厭氧菌 ：10%氧分壓能存活微 需 氧 菌 ：5-10% CO2中能存活,兼性厭氧菌,既能在有氧環(huán)境中又能在無氧環(huán)境中生長的細(xì)菌，即既能以分子氧作為終末電子受體，又能以有機(jī)物作為終末電子受體；既能通過氧化又能通過酵解途徑獲得能量的細(xì)菌。這類菌嚴(yán)格地說

5、一般不屬于厭氧菌的檢驗和研究范圍。,3 .厭氧機(jī)理（4個學(xué)說）,厭氧菌為什么不能在有氧條件下生長繁殖？,(1) 細(xì)胞色素和氧化酶學(xué)說,(2)觸酶和過氧化物酶學(xué)說,（3）Superoxide dismutase(SOD)學(xué)說,（4）分子氧干擾和氧化還原電勢學(xué)說,1) 分子氧干擾厭氧菌的繁殖2)分子氧干擾 RNA的合成3) 一般厭氧菌在 -100mv~ - 250mv才能生長, Eh比游離氧更重要, 產(chǎn)氣莢膜梭菌只要低Eh, 即使環(huán)境

6、中有少量氧也生長.,4.厭氧菌分類的變遷和檢索,(一)革蘭氏陰性無芽孢厭氧桿菌,①類桿菌屬（Baeteroides)最初分為3大群,,1.B.fragilis group,B. animal group（動物群）,B.fragilis group（脆弱類桿菌群）,2.B.oralis group prevotella 口腔菌群,3.B.melaninoge nicus porphyromonas（產(chǎn)黑色素類桿菌）,,,,

7、類桿菌屬新增4個菌種,纖維類桿菌（B.gracilis),糞類桿菌（B.caccae),屎類桿菌（B.merdae),便類桿菌（B.stercoris),,類桿菌屬,包括25個菌種,普雷沃氏菌屬,包括17個菌種,卟啉單胞菌屬,包括9個菌種,新增加來自動物口腔 4個菌種（p.cangingiralis)(p.macacae),獼猴卟啉單胞菌(p.macacae),犬齒齦卟啉單胞菌(p.cangingiralis),利氏卟啉單胞菌(P

8、.levii),卡氏卟啉單胞菌（P.cafoniae),,,,,,梭桿菌屬Fusobacter ium,新增加3個新種和3個亞種,齦溝梭桿菌（F.alocis),溝跡梭桿菌（F.sulci),潰瘍梭桿菌（F.ulcerans),具核梭桿菌文森氏亞種、多形亞種、動物亞種（F.nucl.sub.polymorphum多形Sub.vincentii 文森氏, Sub.animalis 動物）,,②梭桿菌屬,③二氧化碳嗜纖維菌屬新增二

9、個菌種,溶血二氧化碳嗜纖維菌（C.heamolytica),顆粒二氧化碳嗜纖維菌屬（C.granuluca),,有害月形單胞菌（S.noxia),④月形單胞菌屬新增加七個菌種,佛路格氏月形單胞菌（S.flueggei),致傷月形單胞菌（S.infelix),戴安娜月形單胞菌（S.dianae),阿特米斯月形單胞菌（S.artemidis),嗜酸血月形單胞菌（S.aidaminophila),乳酸月形單胞菌（S.lacticifex),,

10、⑤ 新增加一個菌屬稱為嗜膽菌屬（Bilophila)包括一個菌種:沃氏嗜膽菌(B.wadworthia),（二)革蘭氏陽性無芽孢桿菌,1 .雙歧桿菌 包括31個菌種24個亞種共55種,新增加7個菌種,高盧氏雙歧桿菌（B.gallicum),雞胚雙歧桿菌（Ｂ.gallinarum),反芻雙歧桿菌（B.ruminantium),波倫亞雙歧桿菌( B.saeculare),瘤胃雙歧桿菌(B.merycium),殊形雙歧桿菌(B.inopin

11、atum),棲牙雙歧桿菌(B.denticolaens)(96年從口腔分離新定菌種),,其中兩歧雙歧桿菌有a,b兩個亞種;嗜熱雙歧桿菌有a,b,c,d 4個亞種;嬰兒雙歧桿菌有a,b兩個亞種,亞種中還有游離型和乳酸型兩個亞型;青春雙歧桿菌有a,b,c,d 4個亞種;假長雙歧桿菌有a,b,c,d 4個亞種.長雙歧桿菌也有a,b兩個亞種.,2.乳桿菌屬 包括50個菌種7個亞種,新增加菌種,,3. 丙酸桿菌屬

12、 包括兩大群共9個種,其中皮膚群3個菌種。原蛛網(wǎng)菌屬取消，已歸于丙酸桿菌屬, 原丙酸蛛網(wǎng)菌被稱為丙酸丙酸桿菌(P.propionica).,4. 放線菌屬現(xiàn) 包括15個菌種,新增加3個菌種,3.白納德放線菌(A.bernardiae)(90年以后面部或口腔分離菌種）,2.杰稅斯放線菌 （ A.gerencseriae）,1.杰格氏放線菌(A.georgiae)(90年后從面部或口腔分離菌株),,5.優(yōu)桿菌屬 包括

13、36個菌種,（三）革蘭氏陽性無芽孢 厭氧球菌,1.消化球菌屬 只有黑色消化球菌一個種,2.消化鏈球菌屬 包括14個菌種,新增4個菌種,,,1.產(chǎn)氫消化鏈球菌（P.hydrogenalis) 90年從,糞便,陰道,2.淚液消化鏈球菌（P.lacrimalis) 92年從 眼淚分離,3.陰道消化 鏈球菌(P.vaginalis) 92年從陰道分離,4 .解乳消化鏈球菌(P.lactolyticu

14、s) 92年從消化牛乳分離,3.鏈球菌屬 包括6個群36個菌種，其中厭氧鏈球菌群4個菌種含釀膿、口腔、腸球、產(chǎn)乳酸、厭氧和其它群。,,其中,釀膿鏈球菌群（pygenic streptococci group)5個種,口腔鏈球菌群（Oral streptococci group)9個菌種,腸球菌群(enterococci group)10個種,乳酸鏈球菌群（Lactic streptococci group)3個種,厭氧

15、鏈球菌群(Anaerobic streptococci group)4個種,其它鏈球菌群(other streptococci group)5個種,4.瘤胃球菌屬,5.葡萄球菌屬 其中有一個種即解糖葡萄球菌為厭氧菌種。,（四）革蘭 陽性芽孢桿菌— 梭狀芽孢桿菌屬 （Clostridium),,包括85個菌種和亞種,新增加2個菌種,2.毛狀梭菌（C.piliforme),1.隱藏梭菌

16、 (C.celatum),,5.正常菌群中的厭氧菌,注：0表示無或很少，+表示常有；++表示大量存在；+表示不規(guī)則。,二、厭氧培養(yǎng)方法簡介,一個成功的厭氧培養(yǎng)不僅分離培養(yǎng)時保持厭氧，而且在標(biāo)本的采集、輸送、培養(yǎng)基制備及接種等過程盡量要求厭氧操作，任何一個環(huán)節(jié)失誤，都可能導(dǎo)致厭氧菌培養(yǎng)失敗。,(一)主要厭氧培養(yǎng)方法,1）物理方法：阻斷空氣法、煮沸法、真空法、置換法、燃燒法、噴射換氣法如轉(zhuǎn)管法。,2）化學(xué)方法：焦性沒食子酸法、鐵絲絨法、保險

17、粉法、厭氧培養(yǎng)器。,3）生物方法：耗氧法、燕麥發(fā)芽法,4）混合方法：厭氧袋（Gas-kit), 厭氧罐（Gas-pak), 厭氧手套箱（anaerobic glovebox),厭氧培養(yǎng)皿 酶系統(tǒng)（瓊脂內(nèi)）+自動厭氧器。,,,,,,,,,,,,,,,,,還原型,5. N

18、 2HO¯ (CH2)2N S N(CH3)2 還原酶,（二）主要反應(yīng),1.CO2和H2的 產(chǎn)生,3.Cu+H2SO4 CuSO4+H2,2. O2消耗 2H2+O2 鈀 2 H2O,Na(K)BH4+2H2O NaBO2+4H2,C6H8O7+3NaHCO3 Na3(C6H5O7

19、)+3CO2 +3H2O,,,,,,,60%硫酸銅溶液 ,吐溫-80 2%,加入2N H2SO4 1000ml,4 CrSO4+2H2SO4+O2 2Cr2(SO4)3+3H2O,,,,,,,6.指示劑 6%GS : 0.1N NaOH : 0.05%亞甲蘭 =2:0.1:0.2,(CH3)2N,,N,,,,,,,,,,,,S,N(CH3)2,,亞甲蘭,,,可擰開的瓶帽,,三、厭氧菌的鑒定方法簡介,（一）臨床

20、常見疾病與厭氧菌感染,（二）厭氧菌檢驗,1.厭氧菌感染的病源學(xué)特點：,1）感染面與臨床各科所在的部位有關(guān)，有的感染率可達(dá)100%，60%以上標(biāo)本為混合感染。,2）混合感染現(xiàn)象： a 單種使用某種抗生素開始有效，很快無效。 b 病源涂片常只見腸球菌感染，并多易變性易改性。,3）檢出率為57-78%，國內(nèi)30-67%,4）繼發(fā)性和慢性遷延性感染多見。,2、厭氧菌感染的臨床和 細(xì)菌學(xué)特征,,（二）

21、厭氧菌檢驗,1. 標(biāo)本采集,一個成功的厭氧培養(yǎng)總是從采集標(biāo)本開始。,原則：一切污染正常菌群的標(biāo)本都不宜做此檢驗，如咳痰、齒齦拭子、 糞便、排泄尿、洗胃液等。,2. 標(biāo)本輸送,原則：厭氧條件下常溫、混合氣體中輸送，輸送時保持一定濕度,3. 分離程序,,4.厭氧菌鑒定的培養(yǎng)基選擇原則,1）根據(jù)病變所在部位選擇培養(yǎng)基種類,1. 側(cè)膿胸穿刺液（P、F、梭）,2. 肝膿腸穿刺液,鏈,類,梭,,,2)根據(jù)疾病診斷（病名）選擇選擇性培養(yǎng)基,韋榮氏

22、,消化鏈,脆,放,,如側(cè)腦膿腫,3）原則上使用選擇性培養(yǎng)基同時宜加用非選擇性培養(yǎng)基平板。,4）厭氧菌培養(yǎng)的特殊性 厭氧培養(yǎng)一定要加用需氧培養(yǎng)作為對照。,5.厭氧菌培養(yǎng)基及其組成,1）營養(yǎng)豐富的物質(zhì): 胰蛋白胨、植胨、水解蛋白、 動物肽鏈與蛋白、酵母膏（粉）、牛肉膏、 BHI、甚至血。,2）碳水化合物: 各類糖。,3）還原性物質(zhì): 降低氧化還原電勢 L-鹽酸半胱 氨酸、硫乙醇

23、酸鹽等。,4）鹽類與緩沖鹽類: PBS、 Mg2+ 、Fe2+ 、 Ca2+、 Zn2+等。,5）促生長物：如氯化血紅素（hemin），維生素K 1。,6. Finegold氏厭氧菌三級鑒定法,一級鑒定二級鑒定三級鑒定,一般是初代培養(yǎng)結(jié)果，耐氧試驗選擇性培養(yǎng)基、標(biāo)本來源、菌落和菌細(xì)胞特征報告。特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果,可有助于初步鑒定，如七葉苷膽汁（BBE）平板上出現(xiàn)黑色帶暈大于1mm菌落，經(jīng)檢為G¯ b

24、，染色不均，菌體可見有空泡者，多形態(tài),可初步定為脆弱類桿菌（B.fragilis)。又如在KV血平板上，菌落深陷生長可能是解脲類桿菌和纖維類桿菌。,,一級鑒定,,3 基因探針初步應(yīng)用,制備菌液 點樣（NCP濾膜上） 80℃ 干烤5-10min及變形處理 預(yù)雜交液 加入雜交液 加入顯色劑 結(jié)果。 我們的經(jīng)驗是敏感性為89%，特異性91.7%。對脆弱類桿菌靈敏度為10pgDNA和104

25、CFu/mL，能準(zhǔn)確確診。,,,,,,,1厭氧菌藥敏使用的培養(yǎng)基,（1）GAM：胰胨10g 眎胨5.0g等,（2）W-C：胰酶水解酪蛋白10g，酵母粉5g,葡萄糖1g, 氯化納5g， L-半胱氨酸 1g，Vk10.5mg ，氯化血紅素 0.5µg 瓊脂15-20g PH7.2,藥敏的主要方法,1.K-B紙片法2.國際厭氧菌藥敏標(biāo)準(zhǔn)方法——限量瓊脂 稀釋法3.試管稀釋法4.微量稀釋法,一、受試

26、菌的準(zhǔn)備,二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備,三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備,四、抗生素的MIC試驗,五、結(jié)果觀察,厭氧菌的藥敏方法介紹,5.每次藥敏試驗受試菌中應(yīng)注意加入標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控.,①B.fragilis脆弱類桿菌(ATCC 25285或NCTC 9343),②B.thetaiotaomicron多形類桿菌(ATCC 29741),③C.perfringens產(chǎn)氣莢膜梭菌(AATCC 13124),④E.lentum遲緩真桿菌(ATCC 43055),

27、6.瓊脂稀釋法中質(zhì)控菌株MIC值(?g/ml)允許范圍（表1）,表1 質(zhì)控菌株MIC允許范圍(ug/ml青霉素u/ml),續(xù)表1 質(zhì)控菌株MIC充許范圍(µg/ml青霉素u/ml),續(xù)表1 質(zhì)控菌株MIC充許范圍(µg/ml青霉素u/ml),*此表引自美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)對厭氧菌藥敏規(guī)定介紹 1996.12**實用抗菌藥物學(xué)第二版 戴自英等主編 上?？茖W(xué)

28、出版社，1997,二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備,1.準(zhǔn)確稱取抗生素(我們一般稱取2.56g,加DW或其它液體4ml)，以對倍稀釋法稀釋成系列濃度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5?？股亓康倪x擇可據(jù)上表敏感范圍作中點向上、向下各稀釋5個濃度。,2. 用于稀釋抗生素的常用液體的選擇列于表2 (其它未標(biāo)明的抗生素均可用無菌水溶解),表2 稀釋抗生素常用液體,關(guān)于厭氧菌藥敏的K-B（紙片法）,說明：

29、厭氧菌的藥敏試驗一般不宜使 用K-B法做敏感試驗，提倡使用試管或瓊脂稀釋法做藥敏，有時為了臨床需要也做K-B法, 提供臨床參考。,方 法,1.紙片的制備：選用國產(chǎn)新華Ⅰ號濾紙，使用打孔機(jī)制備成為6mm紙片。,2. 紙片干熱滅菌（120℃）2h滅菌。,3. 按表4配好各種抗生素濃度。,表4 紙片法各種抗生素配制及判定標(biāo)準(zhǔn)（引自國內(nèi)1993發(fā)表資料