過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶_hrp_中的若干問題及高效果的標(biāo)記方法

1、第16卷第6期生物化學(xué)與生物物理學(xué)報1984年11月AOTABl(X)H工M工CAe七B工OPHYSICAS工NICAVol.16No.6Nov.1984過碘酸鈉氧化辣根過氧化物酶(HRP)中的若干問題及高效果的標(biāo)記方法I五互宋光承陳彩云(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)山心寄生蟲病研究所上海)摘要術(shù)文研究了過碘酸鈉氧化HRP的某些條件。戊二醛和磷酸鹽對酶有一定的影響而低濃度甲醛和醋酸鹽緩沖液(HAoB)則無明顯影響。氧化的最適pH在5.6左右。過碘酸鈉氧

2、化酶的適宜濃度在0.06~O015肛之間。氧化時間為10~30分鐘過長則影響結(jié)合物效價。討論了加人乙二醇的必要性。醛化的HRP在pHg左右與抗體結(jié)合作用的適宜時間為16~24小時過長則影響酶與抗體的活性過短則結(jié)合不夠完全。封閉結(jié)合物上多余醛基的KBH‘適宜量為0.1~0.219Ing酶。本法標(biāo)記抗體、抗原和葡萄球菌A蛋白的效果均較好方法簡易標(biāo)記效果取決于酶是否能與抗體和抗原相結(jié)合以及標(biāo)記過程中酶和抗體活性是否受影響。用HRP標(biāo)記抗體或抗

3、原的方法基本上可分成2類。一類系用雙功能基團(tuán)的化合物使酶與抗體隨機(jī)偶聯(lián)如戊二醛一步法〔習(xí)。由于酶分子上游離氨基極少而抗體分子上氨基則相對地多為了彌補(bǔ)這一缺陷往往采用8~12個酶分子與1個抗體分子的比值進(jìn)行調(diào)整。戊二醛二步法的原理主要是HRP的氨基極少而加入的戊二醛分子數(shù)相對地多當(dāng)戊二醛中的一個醛基與酶分子上的一個氨基結(jié)合后則余下的一個醛基再與另一酶分子上的氨基作用的可能性極少故很少產(chǎn)生酶與酶間的偶聯(lián)。當(dāng)去除未作用的戊二醛后已醛化的酶與抗

4、體作用而成為結(jié)合物〔幻但這一方法標(biāo)記效果也并不理想。另一類系用過碘酸鈉氧化酶分子中的含糖部分使酶本身產(chǎn)生多個醛基酶的活性中心未受影響或影響不大而醛化了的酶再與待標(biāo)記物作用即可獲得結(jié)合物。這一方法由Nakane等首創(chuàng)〔3其特點(diǎn)是標(biāo)記效果高而所得的結(jié)合物分子量較大。上述方法除標(biāo)記效果較差的戊二醛一步法外操作均較復(fù)雜。駱加里等(198勸〔4J報道了HRP標(biāo)記抗原和抗體的簡易方法并將戊二醛二步法與過碘酸鈉法結(jié)合起來試圖獲得更好的標(biāo)記效果但結(jié)果表

5、明戊二醛一過碘酸鈉法不如甲醛一過碘酸鈉法好。為了闡明這一原因并進(jìn)一步提高標(biāo)記效果探討了過碘酸鈉在氧化HRP時的若干條件及結(jié)合中的某些問題并在這一基礎(chǔ)上建立了簡易、穩(wěn)定、高效的方法。材料和方法HRP東風(fēng)生化試劑廠1976年產(chǎn)品RZ一2.78SigmaV工RZ一3.1或用戊二不文195昌年9月2盛日收到。“本項研究得到聯(lián)合國開發(fā)計劃署世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病、帶病研究培訓(xùn)特別規(guī)劃的部分文持。絲蟲病合作中J時世界銀行世界衛(wèi)生組織熱生物化學(xué)與

6、生物物理學(xué)報16卷Na1O濃度降低時的氧化效果進(jìn)行了如下實驗:將酶溶于不同緩沖液中使成10mgml的濃度每1一種酶溶液又各等分為2加等量0.06萬NaIO‘溶液者為A組加等量o03MNaIO‘溶液者為B組。兩組于4oC氧化30分鐘以后各步均按一般標(biāo)記法進(jìn)行并紀(jì)錄實驗中的顯色情況和pH結(jié)果見表lo表l岡川04于不同p日緩沖液中氧化日Rp的情況實驗階段組別測定和溶解酶的0.2叮溶液及反應(yīng)結(jié)果觀察內(nèi)容NaHP(〕4HAcBPHS.6汪AcBp

7、H4.6HAcBPH3.6水熔解酶后的溶液PH455.往1.23.051液色橙橙橙橙橙加入NaIO4溶液氧化A液色黃灰綠橙灰綠灰綠灰綠灰綠10~30分鐘后的溶液B液色黃橙微橙灰綠淡橙灰綠微橙灰綠橙灰綠刀日乙二醇一NaCI溶液后八pH生.15.23.92.64.9氧化10~30分鐘的溶液B液色橙黃橙橙稍淡淡橙橙PH4.15.24.12.751液色橙黃橙橙稍淡淡橙登加水溶解乙醇沉淀物后APH5.45.15.14.85.1的溶液B液色近無色橙

8、橙稍淡淡橙橙PH5454545.05.1液色近無色橙橙稍淡淡橙橙結(jié)合物A效價幸6~7十54~56B效價75十56十為了確定最適pH將酶分別溶于O.ZMpH6.O的rB、0.2MpH5.6的HAeB、O.ZM醋酸鈉(NaAe)及水測得的pH分別為:5.6、6.6、6.6及5.0。再加等量0.06萬的N叔O水溶液氧化其余條件同一般標(biāo)記法。測得的各結(jié)合物效價分別為:3、7~8、7~8十及7。說明除用PB作溶劑效果較差外其余三者差別不大。三、N

9、aIO氧化的適宜濃度將10mgml濃度的酶的水溶液加等量的0.12萬、0.06萬、o.o3M、o.01M及0.o1MN缸O溶液。其效價分別為7、7斗一、7十、5及1。四、NaIO氧化的適宜時間將酶分別溶于水或O.ZMpHS.6的HAcB或0.腸萬NaAc中各加等量O.06MNa1O4分別氧化10、15、30分鐘或1小時。凡氧化10~30分鐘者除以水作溶劑的為7十外其余均為8。氧化1小時者結(jié)合物效價均相對地降低。五、抗體與醛化酶結(jié)合的適宜