微囊藻毒素及其衍生物抑制蛋白磷酸酶PP1生物活性差異機制研究.pdf

1、微囊藻毒素（Microcystins，MCs）作為一類生物毒性明顯、難降解的有機污染物已引起了全社會的廣泛關注。MCs進入生物體后會靶向攻擊肝細胞，并特異性抑制蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase，PPs）的生物活性，打破多種功能蛋白磷酸化-去磷酸化平衡，進而造成細胞生理功能紊亂、損傷甚至凋亡壞死。鑒于MCs存在顯著的生物毒性，控制MCs濃度水平、闡明其毒性作用機制、探討解毒機理已成為環(huán)境科學工作者的研究熱點。目前關于MC

2、s毒性作用調控的各種策略已經(jīng)被廣泛實施，但由于具體的分子調控機制尚未闡明，制約了相應調控策略的應用。例如：MCs存在80余種同系物，不同類別毒素對 PPs的抑制作用存在一定差異，有關其致毒的種間差異機制研究尚未開展；目前飲用水消毒是調控MCs的關鍵技術，該過程產生的部分特征消毒副產物可能保留原毒素的結構及毒性，消毒副產物轉化解毒的分子機制尚不明確；生物解毒研究證實生物體內MCs能夠在谷胱甘肽S-轉移酶的催化作用下與谷胱甘肽共價結合生成低

3、毒性復合物，但其具體的解毒機制尚未闡明。本研究通過分析MCs污染特性、結構理化特征、毒性作用機制、調控策略的技術問題，以MCLR為基礎研究物，通過傳統(tǒng)氯消毒工藝和碳碳雙鍵-巰醇的親電加成反應分別制取MCLR-DBPs和MC-GSHs；借助分子毒性試驗和分子對接技術對MCs、MCLR/MCLR-DBPs、MCs/MC-GSHs與PP1結合物的毒性作用和結構特征進行解析；將理論模擬數(shù)據(jù)與毒性試驗結果相對照，探究MCs、MCLR-DBPs、M

4、C-GSHs抑制PP1生物活性毒性作用差異機制，建立了對MCs及其衍生物毒性效應進行全面評價的新方法。
　　本研究主要內容包括：⑴微囊藻毒素同系物抑制蛋白磷酸酶PP1生物活性種間差異機制研究借助分子毒性試驗獲得MCs對PP1生物活性的抑制作用順序為：MCLR（2.6μg/L）＞MCLF（4.4μg/L）＞MCLA（5.53μg/L）＞ MCLY（7.9μg/L）＞MCLW（13.6μg/L）。通過MOE分子模擬對MCLR-PP1進

5、行結構改造得到其它毒素與PP1的結合產物并進行分子對接，可以從毒物配體與PP1受體結合前后整體能量變化、結合面積、氫鍵、共價鍵、Mn2+參與的離子鍵作用層次對MCs抑制PP1生物活性的差異機制進行闡釋。結果表明：可變氨基酸位點 Z4的親疏水性與空間位阻效應能夠干擾MCs對PP1的毒性抑制作用（影響配體Adda5殘基與PP1的結合），使得Adda5與PP1的結合面積和毒素毒性變化存在正相關；氫鍵、離子鍵等相互作用及親疏水性的差異與 MCs

6、-PP1結合物的能量變化具有一定的相關性（且親水性作用對結合能量的變化影響大于疏水作用），MCs與PP1對接后整體能量下降程度與毒物毒性變化正相關；極性作用和疏水作用對MCs與PP1結合產物的氫鍵形成存在一定競爭且空間位阻對氫鍵作用存在一定影響；相對于 MCLR與PP1的氫鍵作用而言，Z4→Glu275氫鍵與毒物毒性變化正相關，Leu2←Arg96、IsoAsp3←Arg96和IsoAsp3←Tyr134氫鍵與毒性變化負相關；對于Mn2

7、+參與的離子鍵作用而言，Mn2+-His173、Mn2+-Asn124、Mn2+-Asp92及整體離子鍵作用與PP1活性正相關，與MCs毒性變化存在負相關性。⑵MCLR典型消毒副產物抑制蛋白磷酸酶PP1生物活性差異機制研究借鑒傳統(tǒng)氯消毒工藝制備 MCLR-DBPs，借助分子毒性試驗獲得 MCLR及MCLR-DBPs對PP1生物活性的抑制順序為：MCLR（2.6μg/L）＞P3（21.3μg/L）＞P1（32.7μg/L）＞P4（73.8

8、μg/L）＞P2（113.7μg/L）＞P5。采用MOE分子模擬技術，對MCLR-PP1進行結構改造分別得到各MCLR-DBPs與PP1結合物，再分別對其進行對接模擬。研究發(fā)現(xiàn)：配體、Adda5殘基與PP1的結合面積及配體與 PP1的整體能量變化和毒物毒性變化正相關，表明消毒過程通過破壞毒素（特別是Adda5）與PP1的結合，從而削弱其毒性；消毒副產物參與的Leu2←Arg96氫鍵作用受到抑制，同時 Mdha7←Glu275、IsoAs

9、p3←Arg96、Mdha7←Gly274、Adda5←Arg221和 Glu6←His125氫鍵作用得到強化，從而削弱了 MCLR的生物毒性；配體與PP1的共價鍵 Mdha7-Cys273和毒性變化不具有明顯相關性，但 PP1的分子內Cys273-Asn278和毒物毒性具有負相關性，表明消毒過程促進了該作用，從而間接削弱MCs的生物毒性；對于Mn2+參與的離子鍵作用而言，MCLR-DBPs與PP1的離子鍵Mn2+-His173、Mn2

10、+-His248、Mn2+-Asp64及整體離子鍵作用明顯增加，與PP1的活性正相關，表明MCLR向MCLR-DBPs的轉化強化了上述指標從而實現(xiàn)毒素毒性的降低。⑶微囊藻毒素與谷胱甘肽結合產物抑制蛋白磷酸酶PP1生物活性差異機制研究模擬親電加成反應制取 MCLR-GSH和 MCRR-GSH，通過分子毒性試驗確定MCs/MC-GSHs對PP1生物活性的抑制順序為：MCLR（2.6μg/L）＞MCRR（23.3μg/L）＞MCLR-GSH（

11、83.4μg/L）＞MCRR-GSH（95.1μg/L）。利用MOE分子對接軟件，首先對MCLR-PP1進行結構改造分別得到MCRR、MCLR-GSH、MCRR-GSH與PP1結合物，再分別進行對接模擬。結果表明：Adda5殘基與PP1的結合面積和毒素對 PP1毒性作用正相關，表明引入 GSH通過破壞 Mdha7與Cys273的共價結合，減弱了 Adda5殘基與 PP1作用，削弱毒素毒性；引入 GSH通過減弱 MC-GSHs和 PP1及

12、 H2O的共同作用、X2←Arg96、Glu6?Tyr272、Arg4→Glu275氫鍵或促進 Mdha7-GSH→Asn278、 Mdha7-GSH→Asn271、Adda5←Arg221氫鍵作用，降低毒素毒性；引入GSH后Cys273-Mdha7共價作用減小為零，表明GSH與MCs的Mdha7結合抑制該共價作用，從而削弱毒素毒性；對于 Mn2+參與的離子鍵作用而言，引入 GSH，增強 Mn2+-His173和 Mn2+-Asp92離