牛奶中酪蛋白含量的測(cè)定

1、牛奶中酪蛋白的提取及含量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂類(lèi)（4%）、蛋白質(zhì)（3.5%）、維生素、微量元素（Ca、P等礦物質(zhì)）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一種二糖，它由D半乳糖分子和D葡萄糖分子通過(guò)β14糖苷鍵連接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，當(dāng)乙醇混入乳糖水溶液中時(shí)，乳糖會(huì)結(jié)晶出來(lái)，從而達(dá)到分離的目的。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和乳清蛋白兩種，其中酪蛋白占了牛乳蛋白質(zhì)的80%。酪蛋白是白色、無(wú)味的

2、物質(zhì)，不溶于水、乙醇等有機(jī)溶劑，但溶于堿溶液。而乳清蛋白水合能力強(qiáng)，分散性強(qiáng)，在牛乳中呈高分子狀態(tài)。2、等電點(diǎn)沉淀法：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等電點(diǎn)為4.7左右（不同結(jié)構(gòu)的酪蛋白等電點(diǎn)有所不同），本實(shí)驗(yàn)中將牛乳的pH

3、調(diào)值4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。市售牛奶通常會(huì)添加耐酸堿穩(wěn)定劑來(lái)增加粘稠度，以致即使pH調(diào)至等電點(diǎn)酪蛋白也沉淀的很少，故實(shí)驗(yàn)時(shí)可將pH稍微調(diào)過(guò)多一點(diǎn)再調(diào)回等電點(diǎn)。同時(shí)，市售牛奶由于生產(chǎn)過(guò)程通常導(dǎo)致酪蛋白組分發(fā)生變化，因而使pI偏離了4.7，通常偏酸。3、酪蛋白的提純根據(jù)乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性質(zhì)差異，可以用純水洗滌來(lái)除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的雜質(zhì)，再用乙醇除去脂類(lèi)，然后過(guò)渡到用乙醚洗滌，由于乙醚很快揮發(fā)，最終得到純粹的酪蛋白結(jié)

4、晶。4、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法）考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性。考馬斯亮藍(lán)G520的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)呈藍(lán)色，其最大吸收峰變?yōu)?95nm。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G520蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、器材：恒溫水浴鍋、離心機(jī)、抽濾裝置、蒸發(fā)皿、精密pH試紙、旋渦混合器、

5、紫外分光光度計(jì)、試管9、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL量筒、電子分析天平2、試劑：鮮牛奶、pH4.7醋酸醋酸鈉緩沖溶液、乙醇乙醚混合液（95%乙醇、無(wú)水乙醚體積比1：1）、0.9%NaCl溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（0.1mgmL牛血清蛋白）、考馬斯亮藍(lán)G520染液三、實(shí)驗(yàn)操作記錄1、酪蛋白的制備010203040506070809000.10.20.30.40.50.60.70.80.9標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)濃度（μgmL）A595nm由散點(diǎn)圖

6、可以看出，后兩個(gè)點(diǎn)與前面幾個(gè)點(diǎn)的線性關(guān)系并不好，出現(xiàn)了明顯的負(fù)偏差。故在線性擬合時(shí)舍去后兩個(gè)點(diǎn)，取前5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合。擬合出的直線R達(dá)到0.983，線性較好。2、樣品液的吸光度是0.324，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得酪蛋白濃度為28.40μgmL。稱(chēng)取的酪蛋白樣品質(zhì)量為0.0267g，稀釋倍數(shù)為500倍。=ω（酪蛋白）=酪蛋白濃度1.0500樣品質(zhì)量100%28.4010?615000.0267100%=53.2%五、誤差分析與討論1、本次制備實(shí)驗(yàn)中

7、得到的蛋白質(zhì)量較多，但純度較低，分析原因如下：1）得到的蛋白質(zhì)略呈黃色，且有些發(fā)粘，說(shuō)明可能脫脂不徹底，蛋白質(zhì)產(chǎn)品中含有脂質(zhì)。2）考馬斯亮藍(lán)G520染液中有沉淀，最后影響考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)復(fù)合物溶液的吸光度。3）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)操作上可能有誤差，如往試管中加入溶液時(shí)掛在管壁，且最終也沒(méi)有與下方溶液混合均勻，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度可能不準(zhǔn)，致使標(biāo)準(zhǔn)曲線不準(zhǔn)，數(shù)據(jù)處理時(shí)也發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)線性并不好，尤其是濃度較大時(shí)，雖然可能是超出考馬斯藍(lán)線性范圍，但不能排