藥用真菌粗多糖蛋白含量測定方法

1、食用菌學報@201017(1)：72～75文章編號：1005—9873(2010)01—0072—04藥用真菌粗多糖蛋白含量測定方法周帥，唐慶九，楊焱，賈薇，劉艷芳，唐傳紅，馮娜，劉方，張勁松。(國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部應用真菌資源與利用重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海市農(nóng)業(yè)科學院天然藥用資源研究與開發(fā)中心，上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，上海201106)摘要：以藥用真菌姬松茸(Agaricusblaze

2、i)、雞腿菇(Coprinuscomatus)、猴頭(Hericiumerinaceus)、灰樹花(Grifolafrondosa)和靈芝(Ganodermalucidum)的水提多糖為材料，采用二喹林甲酸法、考馬斯亮藍法、福林一酚法、紫外分光光度法、離子色譜法和傳統(tǒng)凱氏定氮法對其中的蛋白含量進行測定和比較分析。結(jié)果表明，不同測定方法獲得的蛋白含量測定值有差異；筆者推薦使用離子色譜法進行精確蛋白含量測定，采用福林一酚法進行快速趨勢比較測

3、定。關(guān)鍵詞：藥用真菌；多糖；蛋白含量；福林一酚法≯離子色譜法近年來，國內(nèi)外針對藥用真菌保健功能的研究越來越廣泛，其中有關(guān)藥用真菌水提多糖的研究數(shù)量明顯增多。由于水提粗多糖中含有部分游離蛋白，所以蛋白含量成為粗多糖常見檢測指標[1]。目前蛋白檢測常用方法有凱氏定氮法、考馬斯亮藍法、二喹林甲酸法、福林一酚法、紫外分光光度法等，還出現(xiàn)了利用離子色譜分析氨基酸來計算蛋白質(zhì)含量的離子色譜法，筆者以5種常見藥用真菌的水提粗多糖為試驗材料，采用上述6

4、種測定方法進行蛋白含量測定，比較各方法的測定值和重復性，并對各測定方法優(yōu)缺點進行分析。1材料與方法11試驗材料姬松茸(Ablazei)、雞腿菇(Ccomatus)、猴頭(Herinaceus)、灰樹花(G。frondosa)、靈芝(G1ucidum)子實體購自磐安市場，粉碎過80目篩后，參照文獻[2，3]的沸水提取方法進行粗多糖提取，水提物冷凍干燥后得干粉。每種藥用真菌3個平行樣，充分混勻后用于蛋白含量測定。12蛋白含量測定方法121二

5、喹林甲酸法(BCA法)使用Applygen公司提供的BCA法蛋白濃度定量試劑盒，參照文獻E41對各水提多糖樣品進行蛋白含量測定。122考馬斯亮藍法(Bradford法)使用GENMEDBradford蛋白濃度定量試劑盒，參照文獻Es]進行測定。123福林一l酚’法(Lowry法)使用上海荔達提供的Lowry法蛋白測定試劑盒，參照文獻I6]進行測定。124紫外分光光度法(UV法)使用BIO—TEKSynergyHT酶標儀，參照文獻[7]進

6、行測定。125凱氏定氮法(Kjeldahl法)使用上海市農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準檢測中心的Kjeltec8100型凱氏定氮儀(FOSS公司)，參照文獻[8]進行測定。126離子色譜法(HAPECPAD法)使用戴安公司高效陰離子交換色譜一安培檢測器(HAPECPAD)，型號DionexICS2500，色譜條件：AminoPacPA10柱(2mm250mm)，流速022mL／min，柱溫30℃，流動相為025mol／LNaOH和1mol／LNa2

7、Ac，上樣量20肛L；以ThermoScientific生產(chǎn)的17種標準氨基酸為標準品，將檢測到的樣品中氨基酸摩爾濃度按照各自氨基酸分子量換算加和后為樣品中總蛋白質(zhì)含量曲]。收稿日期：2009—10—26原稿；2010‘02—05修改稿基金項目：上海市農(nóng)業(yè)科學院青年基金項目的部分研究內(nèi)容作者簡介：周帥(1981一)，男，2006年畢業(yè)于華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，碩士，助理研究員，主要從事藥用真菌多糖提取純化及相關(guān)檢測研究，發(fā)表主筆

8、論文2篇?！疚耐ㄓ嵶髡逧mail：syjal6@saasshGn萬方數(shù)據(jù)74食用菌學報第17卷花、猴頭、雞腿菇總提物中蛋白含量的測定值差依次減小，這說明對于不同種類的藥用真菌來說，其粗多糖中蛋白含量的準確測定對測定方法的要求程度有所不同。同時還對各測定方法的測定值進行了重復性RSD值計算，如表1所示。表1不同檢測方法的重復性RSD值Table1RSDvaluesforproteincontentsdeterminedusingdiff

9、erentmethods表中數(shù)據(jù)是蛋白質(zhì)在粗多糖中的質(zhì)量百分比括號內(nèi)的數(shù)值為該測試方法RSD在6種測試方法中的排位Valuesshownrepresenttheproteincontent(％)ofthecrudepolysaccharidepreparationsvaluesinparenthesesrepresenttheorderofRSDvaluesamongthesixtestprocedures從重復性RSD結(jié)果來看，Kje

10、ldahl法檢測結(jié)果重現(xiàn)性最好，其次是HAPECPAD法和Lowry法，然后是UV法和BCA法，Bradford法檢測結(jié)果重現(xiàn)性最差。在具備較好的準確性的同時，離子色譜法也具有和凱氏定氮法類似的測定耗時較長的缺點，需要在樣品預處理和測定時花費較多的時間，適用于對準確度有較高要求的測定。而用比色法(Lowry法、UV法BCA法和Bradford法)測定藥用真菌水提多糖中蛋白含量普遍節(jié)省時間，盡管這些方法的準確程度會在不同程度上受到干擾物質(zhì)

11、的影響。3結(jié)論通過對本試驗結(jié)果進行分析比較發(fā)現(xiàn)，6種蛋白含量測定方法中，離子色譜法相對于其他測定方法更準確，而Kjeldahl法相對于其他測定方法重復性好，但二者測定時間均較長；而Lowry法和BCA法測定結(jié)果偏高，重復性稍差，但測定時間較短；Bradford法和UV法則準確度不高，重復性也較差。綜合上述分析，筆者認為：對于藥用真菌多糖中的蛋白含量檢測方法的選擇可以從以下2個角度進行：1、從準確檢測角度，筆者推薦離子色譜法；2、從快速檢

12、測、分析趨勢而不要求準確含量的角度，推薦使用Lowry法。參考文獻[13張安強，張勁松，潘迎捷食藥用菌多糖的提取，分離純化與結(jié)構(gòu)分析[J]食用菌學報，2005，12(2)：6268[2]賈薇。劉艷芳，張勁松，等姬松茸菌絲體多糖提取方法初探[J]食用菌學報，2003，10(3)：41—44E3]楊陽，劉承初，賈薇灰樹花多糖的超濾分離及免疫活性研究[J]食品科學，2008，29(9)：277280[4]SMITHPK，KROHNRI，HER

13、MANsoNGT，eta1Measurementofproteinusingbicinchoninicacid[J]AnalBiochem，1987，163(1)：279[5]BRADFORDMMArapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofdyebinding[J]AnalBiochem，19

14、76，72(7)：24825463LOWRYOH，ROSEBROUGHNJ，F(xiàn)ARRAL，efa1ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagentEJ]JBiolChem，1951，193(1)：265275[73蔡武成，袁積厚生物物質(zhì)常用化學分析方法[M]北京：科學出版社，1982[83張龍翔，張庭芳，李令媛生化實驗方法和技術(shù)[M]北京：高等教育出版社，1981[9]薛香菊。劉寧高效陰離子交換色譜