菌種的復蘇傳代及保存標準程序

1、菌種的復蘇傳代及保存標準程序菌種的復蘇傳代及保存標準程序目的：建立菌種的復蘇、傳代及保存標準程序。范圍：適用于檢定用菌種的復蘇、傳代及保存的操作。職責：質管部生物測定人員對本規(guī)程的實施負責。內容：菌種的復蘇與傳代操作均應在生物檢定室陽性對照間或專用超凈工作臺內進行。操作中使用過的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗結束后經121℃30分鐘高溫滅菌處理。1.菌種的復蘇1.1凍干菌種的復蘇檢定用標準菌種，由中國藥品生物制品檢定所提

2、供，為冷凍干燥菌種(0代)。使用前需將其復蘇。1.1.1準備：①用具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。②培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的性質選擇合適的液體培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基）、營養(yǎng)瓊脂（或改良馬丁瓊脂）斜面數(shù)支。③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。1.1.2操作：1.1.2.1將準備妥的冷凍菌種管、滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、培養(yǎng)基移入工作臺。1.1.2.2用砂輪將凍干菌種管頸部挫出

3、刻痕，再75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內待干。1.1.2.3點燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱，用滅菌滴管吸取液體培養(yǎng)基少許，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。1.1.2.4取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內。1.1.2.5另取一支滅菌滴管，在火焰旁吸取適用液體培養(yǎng)基少許，加至菌種管底部，將1.3.2操作：1.3.2.1從低溫冰柜中取出菌種凍存管，室溫下放置使其自然解凍。

4、1.3.2.2將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培養(yǎng)基等移入工作臺。1.3.2.3用75%酒精棉球擦拭菌種凍存管外壁，稍干。1.3.2.4點燃酒精燈，在火焰旁打開菌種凍存管蓋，用一支滅菌滴管吸取解凍的菌懸液，接種至10ml液體培養(yǎng)基中（生孢梭菌需接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中）?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上。1.3.2.5將用過的滴管和菌種管投入消毒液內浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。1.3.2.6將上述接種后的培養(yǎng)基

5、在規(guī)定溫度下培養(yǎng)（細菌在30~35℃恒溫培養(yǎng)1824小時，真菌在23~28℃恒溫培養(yǎng)2448小時，黑曲霉黑曲霉培養(yǎng)5~7天）。1.3.2.7仔細觀察培養(yǎng)物：如呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種，注明菌名、編號、代次和接種日期后，置2~8℃冰箱內保存；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可進行平板分離單菌落。1.3.2.8注意：已解凍的凍存管不可再凍存。2.菌種的接種、傳代菌種的接種、傳代2.1.準備①用具：接種環(huán)、酒精燈。②培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂或改良

6、馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基或適宜的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已干縮，無冷凝水，則不宜再使用。③消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液。④菌種：根據(jù)2010年版《中國藥典》的要求，傳代次數(shù)（n）應不超過4代。2.2將冰箱中取出的菌種斜面，在室溫放置30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室內或超凈工作臺。2.3點燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上，兩試管口平齊靠近火焰旁。2.4用右手在火焰旁轉動兩管的