微生物學(xué)病毒與亞病毒

1、,第三章 病毒和亞病毒,第三章 病毒與亞病毒,第一節(jié) 病毒第二節(jié) 亞病毒第三節(jié) 病毒與實踐,第一節(jié) 病毒,概述 病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu) 病毒的復(fù)制 病毒的溶原性 病毒對理化因素抵抗力,一、病毒的特點和定義,第一節(jié) 概述,1、特點,1）不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有一般化學(xué)大分子的特征。,2）一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸，DNA或者RNA。,3）大部分病毒沒有酶或酶系極不完全，不含催化能量代謝

2、 的酶，不能進行獨立的代謝作用。,4）嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生，沒有自身的核糖體，沒有個體生 長，也不進行二均分裂，必須依賴宿主細(xì)胞進行自身的 核酸復(fù)制，形成子代。,5）個體微小，在電子顯微鏡下才能看見。,6）對大多數(shù)抗生素不敏感，對干擾素敏感。,例如一些簡單的病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼（coat）構(gòu)成，故可把它們視為核蛋白分子。,朊病毒甚至僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成,病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進入細(xì)胞，通過其復(fù)制與表達產(chǎn)

3、生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制（replication）。,第一節(jié) 概述,1、特點,一、病毒的特點和定義,病毒是一類既具有化學(xué)大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細(xì)胞外的感染性顆粒形式，又具有細(xì)胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。,,超顯微的、沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實體,第一節(jié) 概述,1、特點

4、,一、病毒的特點和定義,單細(xì)胞微生物與病毒性質(zhì)的比較,a DNA病毒和RNA病毒中的一部分;b 利福平可抑制痘病毒復(fù)制,第一節(jié) 概述,2、定義,一、病毒的特點和定義,迄今仍無一個科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩x,病毒為具有獨立于其宿主的進化史的絕對細(xì)胞內(nèi)寄生物，它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化（encapsidation）。

5、 -------------（Fields等，1990年）,非細(xì)胞生物,,（真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分,亞病毒(subvirus),,類病毒（viroid)：只含具侵染性的RNA組分?jǐn)M病毒（virusoid)：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒（prion)：只含蛋白質(zhì),,二 病毒的宿主范圍,第一節(jié) 概述,病毒幾乎可以感染所有的細(xì)胞生物，并具有宿主特異性,,,噬菌體（phage）、植物病毒（p

6、lant viruses）動物病毒（animal viruses）,三、病毒的培養(yǎng)和純化,第一節(jié) 概述,同微生物學(xué)其他學(xué)科分支一樣，病毒學(xué)的進步完全得益于研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展。,通過病毒的分離與純化獲得純化的、有感染性的病毒制備物是病毒學(xué)研究和實踐的基本技術(shù)。,1、病毒的培養(yǎng),病毒的培養(yǎng)：二元培養(yǎng)物法,四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的培養(yǎng),噬菌體,,細(xì)菌培養(yǎng)物,,培養(yǎng)液,營養(yǎng)瓊脂平板,,細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮,細(xì)菌平板成為殘跡平

7、板,,若是噬菌體標(biāo)本經(jīng)過適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬斑（plague）。,Microbiology,雙層平板法,優(yōu)點： ①彌補玻璃皿底面不平的缺陷 ②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上 ③形成的噬菌斑較大，更有利于計數(shù),Microbiology,噬菌斑,四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的培養(yǎng),動物病毒,,,實驗動物,雞胚,多種細(xì)胞培養(yǎng),四、病毒的培養(yǎng)和純化,1、病毒的

8、培養(yǎng),植物病毒,,敏感植物葉片,,產(chǎn)生壞死斑，或稱枯斑,蛋白質(zhì)提純方法（鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）,四、病毒的培養(yǎng)和純化,2、 病毒純化,標(biāo)準(zhǔn),,純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性,病毒是有感染性的生物體,,病毒具有化學(xué)大分子的屬性,,純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性,方法,,主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì),,具有一定的大小、形狀和密度,,,差速離心,梯度離心（超速離心）,第二節(jié) 毒粒的性質(zhì),病毒是一類既具

9、有化學(xué)大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細(xì)胞外的感染性顆粒形式，又具有細(xì)胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。,毒粒（病毒顆粒）： 病毒的細(xì)胞外顆粒形式，也是病毒的感染性形式。,一團能夠自主復(fù)制的遺傳物質(zhì),保護遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞，并作為將遺傳物質(zhì)從一個宿主細(xì)胞傳遞給另一個宿主細(xì)胞的載體。,蛋白質(zhì)外殼,包膜,,,,第二節(jié) 毒粒的性質(zhì),一、毒粒的形態(tài)結(jié)構(gòu),1、病毒的大小和形狀,個體

10、小，必需在電鏡下觀察；,不同病毒的毒粒大小差別很大；,毒粒的形狀:動物病毒有球狀、卵圓狀、磚形 植物病毒有桿狀、絲狀、球狀 噬菌體有蝌蚪狀和絲狀,,,,采用各種電鏡技術(shù)觀察毒粒的形態(tài)結(jié)構(gòu),Orf virus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎病毒)（負(fù)染技術(shù)）,Ebola virus ：埃博拉病毒（正染技術(shù)）,Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技術(shù)）

11、,甲型H1N1型流感病毒,SARS病毒,第二節(jié) 毒粒的性質(zhì),毒粒 的化學(xué)組成,毒粒（化學(xué)組成）,,核酸；蛋白質(zhì)；脂類；碳水化合物；,,基本化學(xué)組成,,病毒顆粒在化學(xué)上表現(xiàn)為核蛋白,二、毒粒的化學(xué)組成,1、 病毒的核酸,核酸是病毒的遺傳物質(zhì)； 一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或是RNA；,病毒核酸,,單鏈DNA（ss DNA，single-stranded DNA）；雙鏈DNA（ds DNA）；單鏈RNA（ss R

12、NA）；雙鏈RNA（ds RNA）；,二、毒粒的化學(xué)組成,2、病毒的蛋白質(zhì),病毒蛋白質(zhì),,結(jié)構(gòu)蛋白,非結(jié)構(gòu)蛋白,病毒基因組編碼的，在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生并具有一定功能，但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì)。,構(gòu)成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì),,,殼體蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；,二、毒粒的化學(xué)組成,2、病毒的蛋白質(zhì),病毒結(jié)構(gòu)蛋白的主要生理功能：,1）構(gòu)成蛋白質(zhì)外殼，保護病毒核酸免受核酸酶及其它理化 因子的

13、破壞；,2）決定病毒感染的特異性，與易感細(xì)胞表面存在的受體具 特異性親和力，促使病毒粒子的吸附和入侵；,3）決定病毒的抗原性，能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體；,4）構(gòu)成毒粒酶，或參與病毒對宿主細(xì)胞的入侵（如T4噬菌 體的溶菌酶等），或參與病毒復(fù)制過程中所需要病毒大分 子的合成（如逆轉(zhuǎn)錄酶等）；,一般來說，病毒是不具酶或酶系極不完全的，所以一旦離開宿主就不能獨立進行代謝和繁殖。,第二節(jié) 病毒的性質(zhì),2、病毒

14、的殼體結(jié)構(gòu),殼體或衣殼（capsid）：,包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼，由蛋白質(zhì)亞基按對稱的形式、有規(guī)律地排列而成，是病毒毒粒的基本結(jié)構(gòu)。,殼體結(jié)構(gòu)類型,,螺旋對稱殼體二十面體對稱殼體復(fù)合對稱結(jié)構(gòu),螺旋對稱殼體：亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。,二十面體對稱殼體：構(gòu)成對稱結(jié)構(gòu)殼體的第二種方式是蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的

15、鞘。,具有復(fù)合對稱結(jié)構(gòu)的典型例子是有尾噬菌體（tailed phage）,其殼體由頭部和尾部組成。包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱。,一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),3、 病毒的包膜結(jié)構(gòu),病毒包膜的基本結(jié)構(gòu)與生物膜相似，是脂雙層膜。在包膜形成時，細(xì)胞膜蛋白被病毒的包糖蛋白取代。刺突（spike）：包膜或核衣殼上的突起。,第二節(jié)病毒的性質(zhì),一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),3、 病毒的包膜結(jié)構(gòu),病毒的蛋白質(zhì)殼體和病毒核酸（核

16、心）構(gòu)成的復(fù)合物，又稱核衣殼。,核殼（nucleocapsid）：,僅由核衣殼構(gòu)成的病毒顆粒,裸露毒粒（naked virion）：,如煙草花葉病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）等一些簡單的病毒的毒粒。,包膜（envelope）：,有些病毒核衣殼包裹著的一層脂蛋白膜，它是病毒以出芽（budding）方式成熟時，由細(xì)胞膜衍生而來的。有維系毒粒結(jié)構(gòu)，保護病毒核殼的作用。特別是病毒的包膜糖蛋白，具有多種生物學(xué)活性，是啟動病毒

17、感染所必需的。,有包膜的病毒,,第二節(jié)病毒的性質(zhì),一、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),4、病毒的結(jié)構(gòu)類型,四種主要結(jié)構(gòu)類型,,裸露的二十面體；裸露的螺旋；有包膜的二十面體；有包膜的螺旋；,有些病毒，如有尾噬菌體、痘病毒等結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，不能包括在這些結(jié)構(gòu)類型之內(nèi)。,不同病毒的毒粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有很大的區(qū)別,3、三類典型形態(tài)的病毒及其代表,二十面體對稱的代表-腺病毒,復(fù)合對稱的代表-T偶數(shù)噬菌體,螺旋對稱的代表-煙草花葉病毒(TMV),（1）螺旋對稱

18、的代表-煙草花葉病毒 (tobaco mosaicvirus,TMV),,,有三種類型：纖維狀、直桿狀和彎曲桿狀。衣殼形似一中空柱，內(nèi)包核酸，衣殼粒和核酸呈螺旋對稱形排列。由95％衣殼Pr和5％SSRNA組成。蛋白質(zhì)衣殼由衣殼粒（2130個）一個緊挨一個地呈螺旋排列而成，ssRNA位于衣殼內(nèi)側(cè)螺旋狀溝中。,（2）二十面體對稱的代表－腺病毒(Adenovirus),具有20個面，30條邊和

19、12個頂角。核衣殼由不同數(shù)量的衣殼粒按一定方式排列成對稱體。腺病毒粒子共由252個球形的衣殼粒排列成一個具有廿面的對稱體，線狀dsDNA。噬菌體 X174只有12個衣殼粒，最大的廿面體是由1，472個衣殼粒組成的昆蟲病毒粒子。,絕大多數(shù)噬菌體為蝌蚪形，現(xiàn)以E.coli T4為例，介紹蝌蚪形噬菌體的結(jié)構(gòu)：,大腸桿菌T4噬菌體構(gòu)造,（3）復(fù)合對稱的代表－T偶數(shù)噬菌體,,,95nm,95nm,,65nm,,24環(huán),頸環(huán),,3、病毒的群體形

20、態(tài),包涵體(inclusion body),噬菌斑(plaque),空斑(plaque),枯斑(lesion),,,病毒的群體形態(tài)有：,（1）包涵體（inclusion body）,概念：感染病毒的宿主細(xì)胞內(nèi)，出現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡下可見的大小、形態(tài)、數(shù)量不等的小體，稱為包涵體。在宿主細(xì)胞內(nèi)形成包涵體是病毒的特征，不同的病毒其形成的包涵體具有不同的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、和特性。,包涵體在細(xì)胞中的形成部位： 位于細(xì)胞核

21、內(nèi)—如包疹病毒 位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)—如狂犬病毒等 胞核內(nèi)胞質(zhì)都有—麻疹病毒,包涵體（inclusion body）,是病毒的聚集體;,是病毒的合成部位;,是病毒蛋白和與病毒感染有關(guān)的蛋白質(zhì),非病毒性包涵體,由化學(xué)因子或細(xì)菌感染形成,包涵體的實踐意義—-病毒鑒定、臨床診斷依據(jù)。,(2)噬菌斑(plaque),,噬菌斑是指在宿主細(xì)菌的菌苔上，噬菌體使菌體裂解而形成的空斑。,應(yīng)用：1

22、、噬菌體定量計數(shù)2、噬菌體的鑒定,空斑和病斑,在動物細(xì)胞培養(yǎng)物上的與噬菌斑類似的空斑,稱為病斑.因為受腫瘤病毒感染。 空斑和病斑用于動物病毒粒子的計數(shù)也可以采用噬菌斑法類似的技術(shù)。,枯斑：植物病毒在植物葉片上形成的群體 稱為枯斑。,第三節(jié) 病毒的復(fù)制,病毒的特點：,嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在活細(xì)胞內(nèi)繁殖。,毒粒,,宿主細(xì)胞,,有繁殖性的病毒基因組,,具有感染性的毒粒消失,病毒基因組復(fù)制、表達,,病毒核酸和

23、蛋白質(zhì),裝配形成具有感染性的毒粒,,釋放至細(xì)胞外,,,,,原料；能量；生物合成場所；,,第三節(jié) 病毒的復(fù)制,病毒的復(fù)制：,病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進入細(xì)胞，通過其復(fù)制與表達產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制（replication）。,第三節(jié) 病毒的復(fù)制,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線（one

24、step growth curve）,1939年，Max Delbruck & Emory Ellis：,E. coli / bacteriopage,1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細(xì)胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；3、將上述混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放 的噬菌體感染其它細(xì)胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價（對噬菌體含量 進行計數(shù)）；

25、5、以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價為縱坐標(biāo)，繪制出 病毒特征性的繁殖曲線；,該實驗標(biāo)志著分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的建立Max Delbruck因此榮獲1969年Nobel Prize,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線（one step growth curve）,噬菌體復(fù)制（繁殖）的三個階段：（吸附期）；游離的噬菌體吸附到宿主細(xì)胞1、潛伏期；從噬菌體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的最短時期2、

26、裂解期；隨著菌體不斷破裂，新噬菌體數(shù)目增加，直到最高值3、平穩(wěn)期；,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線（one step growth curve）,,,取培養(yǎng)物直接測定病毒數(shù)量,將培養(yǎng)物過濾去細(xì)胞后測定病毒數(shù)量,將細(xì)胞裂解后測定病毒的數(shù)量。前期可將培養(yǎng)物先離心去上清以消除未吸附病毒的影響,,裂解量：每個受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目。其值等于潛伏期受染細(xì)胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細(xì)胞所釋放的全部子代病毒數(shù)目，即

27、等于穩(wěn)定期病毒效價與潛伏期病毒效價之比。,一、病毒的復(fù)制周期,2、隱蔽期（eclipse period）,,在潛伏期的前一段，受染細(xì)胞內(nèi)檢測不到感染性病毒，后一階段，感染性病毒在受染細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量急劇增加。自病毒在受染細(xì)胞內(nèi)消失到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時間為為隱蔽期。,隱蔽期病毒在細(xì)胞內(nèi)存在的動力學(xué)曲線呈線性函數(shù)，而非指數(shù)關(guān)系，從而證明子代病毒顆粒是由新合成的病毒基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟，而不是通過雙分裂方式產(chǎn)生的。,不同

28、病毒的隱蔽期長短不同，例如，DNA動物病毒的隱蔽期為5～20小時，RNA動物病毒為2～10小時。,,一、病毒的復(fù)制周期,1、一步生長曲線（one step growth curve）,一步生長曲線是研究病毒復(fù)制的一個經(jīng)典試驗，最初是為研究噬菌體的復(fù)制而建立，以后推廣到動物病毒和植物病毒的復(fù)制研究中。,以適量的病毒接種于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的高濃度的敏感細(xì)胞，待病毒吸附后，離心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清處理病毒—細(xì)胞培養(yǎng)物以建立同步感

29、染，然后繼續(xù)培養(yǎng)并定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價，并以感染時間為橫坐標(biāo)，病毒的感染效價為縱坐標(biāo)，繪制出病毒特征性的繁殖曲線，即一步生長曲線。,不同病毒的潛伏期長短不同，噬菌體以分鐘計，動物病毒和植物病毒以小時或天計。,潛伏期：,噬菌體的裂解量一般為幾十到上百個，植物病毒和動物病毒可達數(shù)百乃至上萬個。,裂解量：,一、病毒的復(fù)制周期,3、病毒的復(fù)制周期,復(fù)制周期（replicative circle）或稱復(fù)制循環(huán)：,自病毒吸附于細(xì)胞

30、開始，到子代病毒從感染細(xì)胞釋放到細(xì)胞外的病毒復(fù)制過程。,① 吸附； ② 侵入； ③ 增殖；（包括病毒基因組的表達與復(fù)制） ④裝配（成熟） ⑤ 釋放（裂解）；,第三節(jié) 病毒的復(fù)制,二、病毒感染的起始,1、吸附：,毒粒,敏感細(xì)胞,隨機碰撞而接觸（靜電引力或氫鍵）,可逆吸附，無特異性（非細(xì)胞顆粒也可吸附）,,,病毒表面蛋白與細(xì)胞受

31、體的結(jié)合,特異性，不可逆吸附，啟動病毒感染的第一階段,二、病毒感染的起始,1、吸附：,病毒吸附蛋白與細(xì)胞受體間的結(jié)合力來源于空間結(jié)構(gòu)的互補性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性相互作用及范得華力。,不同種系的細(xì)胞具有不同病毒的細(xì)胞受體，病毒受體的細(xì)胞種系特異性決定了病毒的宿主范圍。,二、病毒感染的起始,2、侵入：,侵入又稱病毒內(nèi)化，它是一個病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，依賴于能量的感染步驟。不同的病毒-宿主系統(tǒng)的病毒侵入機制不同,二、病毒

32、感染的起始,2、侵入：,有尾噬菌體：,注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞,通過尾部刺突固著于細(xì)胞；尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，是細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；,吸附,尾釘固著,尾鞘收縮,尾管穿入,DNA注入,如果大量噬菌體在短時間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱為自外裂解（lysis from without）。,二、病毒感染

33、的起始,2、侵入：,植物病毒：,通過因人為地或自然的機械損傷所形成的微傷口進入細(xì)胞；或者靠攜帶有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆蟲取食將病毒帶入細(xì)胞。,植物病毒一旦進入細(xì)胞后，增殖產(chǎn)生的子代病毒或病毒核酸可通過病毒編碼的運動蛋白（movement protein）與胞間連絲的相互作用從受染細(xì)胞進入鄰近細(xì)胞。,二、病毒感染的起始,脫殼：,脫殼是病毒侵入后，病毒的包膜和/或殼體除去而釋放出病毒核酸的過程。脫殼是病毒基因組進

34、行功能表達所必需的感染事件。,T-偶數(shù)噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的,動物病毒存在不同的結(jié)構(gòu)類型和不同的侵入方式，其脫殼過程也較復(fù)雜。,第三節(jié) 病毒的復(fù)制,三、增殖,病毒基因組進入胞內(nèi),,宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生改變,,病毒利用宿主的生物合成機構(gòu)和場所，使病毒核酸表達和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。,④ 成熟（裝配）,已合成的各部件進行自行裝配成新的噬菌體的過程。,T偶數(shù)噬菌體裝配過程模式圖,被感染細(xì)胞裂解，成熟的子代噬菌體轉(zhuǎn)移到外界

35、。開始新的生活史。,,,⑤ 裂解（釋放）,,裂解量：平均每一宿主細(xì)胞裂解后所產(chǎn)生的 子代噬菌體數(shù)。,,有囊膜病毒以“出芽”方式釋放,吸附,侵入,早期：病毒特異性酶的合成,病毒核酸復(fù)制,病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成,裝配,釋放,,病毒大分子合成,2、噬菌體效價的測定,效價（噬菌斑形成單位數(shù)、感染中心數(shù)）：每ml樣品中所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)。,測定方法： 斑點試驗法、液體稀釋管法、單層平板法、

36、 雙層平板法、快速玻片法,,,,,,噬菌斑數(shù)=試樣中噬菌體數(shù),雙層平板法,噬菌體與宿主關(guān)系,1、烈性噬菌體：凡能引起宿主細(xì)胞迅速裂解的噬菌體。2、溫和性噬菌體：噬菌體侵染宿主后，并不增殖，裂解，而與宿主DNA結(jié)合，隨宿主DNA復(fù)制而復(fù)制，此時細(xì)胞中找不到形態(tài)上可見的噬菌體，這種噬菌體稱為溫和性噬菌體。含有溫和性噬菌體的細(xì)菌稱為溶源性細(xì)菌lysogenic bacteria,第四節(jié) 病毒的非增殖性感染,溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)：

37、,烈性噬菌體（virulent phage）：,感染宿主細(xì)胞后能在細(xì)胞內(nèi)正常復(fù)制并最終殺死細(xì)胞，形成裂解循環(huán)（lytic cycle）。,溫和噬菌體或稱溶源性噬菌體（lysogenic phage）：,感染宿主細(xì)胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，沒有成熟噬菌體產(chǎn)生。,這一現(xiàn)象稱做溶源性（lysogeny）現(xiàn)象,在大多數(shù)情況下，溫和噬菌體的基因組都整合于宿主染色體中（如λ噬菌體），亦有少數(shù)是以質(zhì)粒形成存在（如P

38、1噬菌體）。,溫和性噬菌體存在狀態(tài),1）游離具感染性的virion；2）前噬菌體（prophage）：附著或整合在宿主染色體上，一道復(fù)制；3）營養(yǎng)期噬菌體：指導(dǎo)合成。,溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)：,整合于細(xì)菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱做原噬菌體（prophage）,在原噬菌體階段，噬菌體的復(fù)制被抑制，宿主細(xì)胞正常地生長繁殖，而噬菌體基因組與宿主細(xì)菌染色體同步復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂而傳遞給子代細(xì)胞。,細(xì)胞中含有以原噬菌體

39、狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細(xì)菌稱做溶源性細(xì)菌（lysogenic bacteria）,溶源性細(xì)菌經(jīng)自發(fā)裂解或誘發(fā)裂解，進入裂解循環(huán),噬菌體的應(yīng)用,噬菌體會給人類造成損失，利用微生物進行發(fā)酵的工業(yè)常深受其害。但是，由于噬菌體的某些生物學(xué)特性，使其在人類的生產(chǎn)實踐和生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究中都有一定價值?？筛爬橐韵聨追矫?。,1)用于鑒定未知細(xì)菌 在醫(yī)學(xué)上，有些難鑒別的病原菌，利用噬菌體對宿主細(xì)胞的高度?；缘拿舾行裕粌H可鑒定到菌種，而且

40、可鑒定到菌型。2)用于臨床 治療某些傳染性疾病。 如果將噬菌體制劑與抗生素或者磺胺藥物配合應(yīng)用，則效果更好。3)檢驗植物病原菌 利用噬菌體可以檢驗由種子攜帶的植物病原菌。4)測定輻射劑量 某些噬菌體(如T2)對輻射劑量的反應(yīng)敏感而精確。5)噬菌體在分子生物學(xué)研究中的作用 噬菌體現(xiàn)已成為進行分子生物學(xué)研究的較為理想的重要材料。,,,（二）植物病毒,,已知的植物病毒多達700種（1989年），多數(shù)是ssRNA病毒。形態(tài)：桿

41、、絲、球狀，一般無包膜。,1619年荷蘭畫師描畫的有病郁金香的畫像。,花葉、黃化或紅化等癥狀,植株發(fā)生矮化，叢枝或畸形等,形成枯斑或壞死等癥狀,植物感染病毒后的主要癥狀,植物黃萎病,,借昆蟲刺吸式口器進入、通過傷口或嫁接進入 ，再通過胞間連絲或輸導(dǎo)組織迅速向其它部位擴散引起普遍感染。,1、“侵入”方式,,3、核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成,2、脫殼植物病毒侵入宿主細(xì)胞后才能發(fā)生脫殼。,,增殖過程,4、裝配（成熟）,（三）人類和脊椎動物

42、病毒,在人類與脊椎動物中廣泛寄生著相應(yīng)的病毒。人類傳染病80％由病毒引起（＞300種），脊椎動物病毒＞900種，許多病毒引起人畜共患病。另一些病毒感染動物后，并不致死宿主細(xì)胞，而是引起腫瘤。,種類,dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA。衣殼外有的有包膜，有的無包膜，有的包膜上有刺突。,增殖過程,與噬菌體的增殖大致相同，可分為五個連續(xù)步驟：1）吸附 具高度專一性地吸附于敏感細(xì)胞表面的受體。2）侵入 以胞飲、包膜溶入

43、細(xì)胞膜、特異受體轉(zhuǎn)移等方式侵入敏感細(xì)胞內(nèi)。3）脫殼 脫去衣殼和包膜。4）生物合成 核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。5）裝配和成熟 分別合成的核酸和蛋白質(zhì)組合成完整的、新的病毒粒子。6）釋放大量有侵染性的子代病毒。,多角體：多數(shù)昆蟲病毒可在宿主細(xì)胞內(nèi)形成光鏡下呈多角形的包涵體。 直徑一般3μm（0.5～10μm），堿溶性蛋白，內(nèi)包裹數(shù)目不等的病毒粒，可在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成。功能：保護病毒粒免受外界不良環(huán)境的破壞。,

44、（四）昆蟲病毒（無脊椎動物病毒）,已知昆蟲病毒1671　種（1990），其中80％以上鱗翅目昆蟲的病原體。,昆蟲病毒的種類,除非包涵體病毒病毒外，可分為：,核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV),質(zhì)型多角體病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus,CPY),顆粒體病毒(granulosis virus,GV),,昆蟲病毒做為生物農(nóng)藥優(yōu)點：,專一性高,毒力大,后效長,使用方

45、便,對人畜安全,無公害,缺點危害經(jīng)濟動物,,,,類病毒(Viroid),擬病毒(Virusoid),朊病毒(Prion),第二節(jié) 亞 病 毒,只含核酸或蛋白質(zhì)一種成分的分子病原體。,包括：,一、類病毒,只含RNA一種成分，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的分子病原體。是寄生于高等生物細(xì)胞中一類最小的新的病原體。ssRNA，分子量約5×104Da～12×104Da，為已知最小病毒分子量的十分之一左右。到目前為止，類病毒只在植物中

46、被發(fā)現(xiàn)。類病毒對各種化學(xué)和物理因子的作用都不敏感，對熱以及紫外光和離子輻射有高度抗性。,類病毒(Viroid),馬鈴薯紡錘塊莖病的病原體,長50nm棒狀RNA分子,179核苷酸180核苷酸,RNA由,組成,兩半體間有70％堿基以氫鍵方 式結(jié)合共形成122個堿基對，27個內(nèi)環(huán)。,Viroid Diseases of Potato,二、擬病毒(virusoids，類類病毒),是包裹在動植物病毒粒子中的類病毒極其微小，僅由裸露的RNA（

47、300～400個核苷酸）或DNA組成。,輔助病毒：類病毒“寄生”的真病毒。擬病毒為輔助病毒的“衛(wèi)星”，其復(fù)制必須依賴輔助病毒的協(xié)助。擬病毒也可干擾輔助病毒的復(fù)制、減輕其對宿主的病害、用于生物防治中。,,,是一類不含核酸的侵染性蛋白質(zhì)分子。小型蛋白質(zhì)顆粒，分子量3.3×104～3.5×104Da,約由250個氨基酸組成。能引起宿主體內(nèi)現(xiàn)成的同類蛋白質(zhì)分子發(fā)生與其相似的構(gòu)象變化而使宿主致病。毒性很強，1g含朊病毒

48、的鼠腦可感染1億只小鼠。,三、朊病毒,引起的疾病羊搔癢病、瘋牛病、瘋羊病、克雅氏病。,朊病毒侵入人體大腦的過程借食物進入消化道，再經(jīng)淋巴系統(tǒng)侵入大腦。,Microbiology,朊病毒（prion，virino）,朊病毒有哪些特點    首先，它沒有核酸，能使正常的蛋白質(zhì)由良性轉(zhuǎn)為惡性，由沒有感染性轉(zhuǎn)化為感染性；其次，它沒有病毒的形態(tài)，是纖維狀的東西；第三，它對所有殺滅病毒的物理化學(xué)因素均

49、有抵抗力，現(xiàn)在的消毒方法都無用，只有在136℃高溫和兩個小時的高壓下才能滅活；第四，病毒潛伏期長，從感染到發(fā)病平均28年，一旦出現(xiàn)癥狀半年到一年100％死亡；第五，診斷困難，正常的人與動物細(xì)胞內(nèi)都有朊蛋白存在，不明原因作用下它的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，變成有傳染性的蛋白，患者體內(nèi)不產(chǎn)生免疫反應(yīng)和抗體，因此無法監(jiān)測。,與真病毒的主要區(qū)別:,（1）在電鏡下，朊病毒呈淀粉樣顆粒狀，成叢排列，每叢大小和形狀不一；（2）無核酸成分；（3）無免疫原性

50、；（4）由宿主細(xì)胞內(nèi)的基因編碼；（5）抗逆性強，能耐殺菌劑（甲醛）和高溫（120～130℃處理4h后仍具感染性）。,人的庫魯病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔癢癥(scrapie),牛海綿狀腦病(spongiform encephalopathy),第三節(jié) 病毒與實踐,病毒與實踐的關(guān)系極密切，由病毒引起人、動物、植物病害，對發(fā)酵工業(yè)的不利影響，利用它們進行生物防治，生化

51、制藥（疫苗生產(chǎn)）和作遺傳工程中的外源基因載體等。,,,,發(fā)酵周期明顯延長,碳源消耗緩慢,發(fā)酵液清淡,發(fā)酵產(chǎn)物形成緩慢或根本不形成,噬菌體檢測會發(fā)現(xiàn)大量噬菌斑,電鏡可見噬菌體,后果：①減產(chǎn)②倒罐,一、噬菌體與發(fā)酵工程,噬菌體對發(fā)酵工業(yè)的危害很大，當(dāng)發(fā)酵液受噬菌體嚴(yán)重污染時，會出現(xiàn)以下異常表現(xiàn)：,發(fā)酵生產(chǎn)時預(yù)防措施,,決不使用可疑菌種,嚴(yán)格環(huán)境衛(wèi)生,活菌液嚴(yán)禁排放,通氣加料嚴(yán)控,嚴(yán)格執(zhí)行會客制度,設(shè)備滅菌,使用抗噬菌體菌株,補救方法：①

52、盡快提取產(chǎn)品,②加藥抑制,③及時更換菌種,二、昆蟲病毒用于生物防治,一部分昆蟲對人類有利，大量的對人類有害。利用病毒制劑進行生物防治。優(yōu)點：（1）致病力強，使用量??；（2）專一性質(zhì)，安全可靠；（3）抗逆性強，作用久長；（4）生產(chǎn)簡便，成體低廉；（5）資源豐富（已發(fā)現(xiàn)的昆蟲病毒近2000種）。,,三、病毒在基因工程中的應(yīng)用,動物DNA病毒作為動物基因工程的載體,噬菌體作為原核生物基因工程的載體,,植物DNA病毒作為植物基因工程

53、的載體,,昆蟲DNA病毒作為真核生物基因工程的載體,在基因工程操作中，病毒是除原核生物外的最好的外源目的基因的載體。,病毒對理化因素抵抗力,1、物理因素主要是溫度、光、干燥?？傻蜏乇４?，但不耐熱，60度，30分鐘。X射線、γ射線、紫外線可滅活。無包膜病毒在相對濕度（RH）較高時存活較好，而有包膜病毒在低RH時存活最好。2、化學(xué)因素：體內(nèi)滅活物質(zhì)是抗體和干擾素體外一般消毒劑可滅活，對氯耐受力比腸道菌強，對酸性不敏感，對高pH敏

54、感。可用脂溶劑（醚、十二烷基硫酸鈉、氯仿、去氧膽酸鈉等）鑒別有無包膜。,3、病毒在環(huán)境中存活：在海水和淡水中，溫度是影響病毒存活的主要因素，與病毒類型也有關(guān)；土壤中受溫度和濕度影響最大，干燥易使病毒滅活；空氣中病毒附著在塵埃上，存活時間受多種因素影響。,內(nèi)容串講,一、細(xì)菌基本形態(tài)（球狀、桿狀、螺旋狀）細(xì)胞結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁：功能革蘭氏染色：G+ 與G-比較化學(xué)組成：肽聚糖（結(jié)構(gòu)）：NAM、NAG、

55、 短肽 磷壁酸與脂多糖細(xì)胞壁缺陷細(xì)菌(protoplast,spheroplast，L-form),細(xì)胞膜：功能，特點細(xì)胞核：特點細(xì)胞質(zhì)及內(nèi)含物：特點 種類及組成核糖體，間體莢膜，鞭毛，菌毛，芽孢（組成，功能，特點）繁殖與菌落，常見常用細(xì)菌二、放線菌結(jié)構(gòu)特點，菌絲，菌落，繁殖， 分類三、

56、立克次氏體 支原體 衣原體 結(jié)構(gòu)特點,四、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁 細(xì)胞膜 細(xì)胞核 其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)繁殖方式與生活史， 常見常用酵母五、霉菌：菌絲 細(xì)胞壁 無性孢子與有性孢子 分類， 常見常用霉菌六、病毒：特點、 形態(tài)（phage）、繁殖與寄主關(guān)系：烈性phage 一步生長曲線溫和性phage存在狀態(tài)（游離態(tài)，

57、營養(yǎng)期， 原噬菌體）溶源性細(xì)菌；特點病毒分類，類病毒，擬病毒，朊病毒,基本要求,一、掌握的內(nèi)容:1.細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)以及功能、繁殖及群體形態(tài).2.放線菌特征及分類.3.酵母菌和霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu) 繁殖方式及菌落特征.4.原核與真核微生物比較.5.病毒化學(xué)組成與形態(tài)構(gòu)造；噬菌體結(jié)構(gòu)，繁殖。,基本要求,二、熟悉的內(nèi)容:

58、1.一些常見常用細(xì)菌、酵母、霉菌、及酵母菌、霉菌生活史.2.立克次氏體、衣原體、支原體3.噬菌體檢查及防治三、了解的內(nèi)容：藍(lán)細(xì)菌，微型藻類,原生動物,病毒分類和亞病毒,復(fù)習(xí)思考題,1．  細(xì)菌、放線菌、酵母、霉菌、病毒各屬哪一類微生物？為什么？2．  前四大類微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、繁殖方式及菌落特征3．  敘述原核與真核微生物的主要區(qū)別4．  G+與G-的區(qū)別5．  分離細(xì)