微生物學課件

1、第7章 微生物的遺傳 變異和育種,遺傳：,親代與子代相似,變異：,親代與子代、子代間不同個體不完全相同,遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質特性之一,遺傳型：,表型（表現型）：,生物的全部遺傳因子及基因,具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現出來的形態(tài)等生物學特征的總和。,表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關。,表型飾變：,表型的差異只與環(huán)境有關特點：暫

2、時性、不可遺傳性、表現為全部個體的行為,遺傳型變異（基因變異、基因突變）：,遺傳物質改變，導致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數個體的行為 （自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）,微生物是遺傳學研究中的明星：,微生物細胞結構簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。,很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。,對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。,第一節(jié) 遺傳的物

3、質基礎,一、DNA作為遺傳物質,二、RNA作為遺傳物質,三、朊病毒的發(fā)現與思考,一、DNA作為遺傳物質,第一節(jié) 遺傳的物質基礎,Avery在四十年代以更精密的實驗設計重復了以上實驗,分別用降解DNA、RNA、蛋白質的酶作用于有毒的S型菌細胞抽提物,,只有DNA被酶降解破壞的抽提物無轉化活性,,DNA是轉化所必需的轉化因子,第一節(jié) 遺傳的物質基礎,（參見 P195）,T2噬菌體感染實驗（1952年）,第一節(jié) 遺傳的物質基礎,（參見

4、 P195）,二、RNA作為遺傳物質,,生化提取分別獲得含RNA的煙草花葉病毒蛋白質外殼（病毒1）和核酸（病毒2）,,抗血清處理，證明雜種病毒的蛋白質外殼來自病毒1，而非病毒2,,雜種病毒的后代的蛋白質外殼表現為病毒2，而非病毒1,,遺傳物質是核酸（RNA）而非蛋白質,第一節(jié) 遺傳的物質基礎,三、朊病毒的發(fā)現與思考,（參見 P191 和 P195）,亞病毒的一種：具有傳染性的蛋白質致病因子，迄今為止尚為

5、 發(fā)現該蛋白內含有核酸。,其致病作用是由于動物體內正常的蛋白質PrP c改變折疊狀態(tài)為PrP sc所致，而這二種蛋白質的一級結構并沒有改變。,人的庫魯病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt Jakob disease, CJD)等,羊搔癢癥(scrapie),牛海綿狀腦病(spongiform encephalopathy),引起人與動物的致死性中樞神經系統疾病,Prusiner (1982)

6、提出羊搔癢病因子是一種蛋白質侵染顆粒（proteinaceous infectious particle），并將之稱做Prion或Virino。 -------朊病毒,1997年，Stanley B. Prusiner榮獲諾貝爾獎,第一節(jié) 遺傳的物質基礎,三、朊病毒的發(fā)現與思考,1）蛋白質是否可以作為遺傳物質？ prion

7、是生命的一個特例？還是僅僅為表達調控的一種形式？,2）蛋白質折疊與功能的關系，是否存在折疊密碼？,DNA→RNA→肽鏈→蛋白質,核 苷 酸 水 平,,密 碼 子 水 平,,基 因 水 平,遺傳物質存在的部位,,核 酸 水 平,,染色體水平,,細胞核水平,,細胞水平,,,,核苷酸水平,,核糖核酸和脫氧核糖核酸,,,基因水平,基因是生物體內具有自主復制能力的最小遺傳功能單位，其物質基礎是一條以直線排列、

8、具有特定核苷酸序列的核酸片段?；蚪M是指存在于細胞或病毒中的所有基因。由于現在發(fā)現許多非編碼序列具有重要的功能，因此目前基因組的含義實際上是指細胞中基因以及非基因的DNA序列組成的總稱，包括編碼蛋白質的結構基因、調控序列以及目前功能還尚不清楚的DNA序列。,,原核生物基因的組成,,操縱子,調節(jié)基因,,結構基因,操作基因,啟動基因,原核生物基因的特點,遺傳信息的連續(xù)性 功能相關的結構基因組成操縱子結構結構基因的單拷貝及rRNA基因的

9、多拷貝基因組的重復序列少而短,真核生物的基因的特點,基因的不連續(xù)性：內含子、外顯子。高度拷貝和重復順序 ：遺傳豐余 。轉錄和轉譯在細胞中有空間分隔 。,,原核生物的質粒,質粒的概念：游離于原核生物基因組以外，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的dsDNA分子，即cccDNA。質粒賦予細菌某些對其生存并非必不可少的特殊功能。如：產毒、抗藥、產特殊酶、降解有毒化合物等,質粒的主要類型,,高拷貝數(high copy number

10、)質粒（每個宿主細胞中可以有10-100個拷貝） ———————松弛型質粒,低拷貝數(low copy number)質粒（每個宿主細胞中只有1-2個拷貝） ———————嚴緊型質粒,,窄宿主范圍質粒(narrow host range plasmid)（只能在一種特定的宿主細胞中復制）,,廣宿主范圍質粒(broad host range plasmid)

11、（可以在許多種細菌中復制）,典型質粒簡介,F質粒：大腸桿菌等部分細菌內存在，決定其性別并具有轉移能力的質粒。R質粒：表現為對抗生素等藥物的抗性。Col質粒：細菌素的概念,在醫(yī)療中具有危害，但可用于微生物篩選和基因工程的標記,部分細菌由質粒編碼的蛋白質產生的能抑制或殺死其他近源細菌的代謝產物。,用于“殘害手足”,Ti質粒：,誘癌質粒，導致植物產生根癌，膨大等現象；用于植物基因工程。,月季根癌,Ri質粒：,發(fā)根質粒，誘發(fā)大量稱為

12、毛狀根的不定根。,降解性質粒：,,僅在假單胞菌（Pseudomonas）中發(fā)現。具有降解復雜有毒化合物的能力?！俺壘?。,,隱秘質粒（cryptic plasmid）,隱秘質粒不顯示任何表型效應，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細胞抽提液等方法才能發(fā)現。,它們存在的生物學意義，目前幾乎不了解。,在應用上，很多隱秘質粒被加以改造作為基因工程的載體（一般加上抗性基因）,第二節(jié) 基因突變和誘變育種,基因突變,,突變類型,

13、突變率,基因突變的特點,基因突變自發(fā)性和不對應性的實驗證明,基因突變及機制,紫外線對DNA的損傷及其修復,基因突變（gene mutation）,基因突變的概念：,泛指遺傳物質的分子結構或數量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產生。,野生型菌株（wild type strain）：,從自然界分離到的菌株。,突變株（mutant）：,野生型經突變后形成的帶有新性狀的菌株。,基因突變的類型,突變株的表型,選擇性突變株,（selectabl

14、e mutant）,,非選擇性突變株,（ non－selectable mutant ）,,營養(yǎng)缺陷型,抗性突變型,條件致死突變型,,形態(tài)突變型,抗原突變型,產量突變型,突變率（mutation rate）,細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。某一基因的突變一般是獨立發(fā)生的，他的突變率不影響其他基因的突變。通常突變發(fā)生的幾率為10-6～10-9,基因突變的特點,1.自發(fā)性。,2.不對應性,細胞可自發(fā)的產生突變,突變性狀與引起

15、突變的原因間無直接對應關系,3.稀有性,突變幾率為10-6～10-9,4.獨立性,5.可誘變性,誘變劑的使用可大大提高突變幾率,6.穩(wěn)定性,7.可逆性,正向突變/回復突變,基因突變自發(fā)性和不對應性的證明,1.Luria等的變量實驗（fluctuation test）2.Newcomb的涂布實驗3.Lederberg等的影印平板法（replica plating）,變量實驗（fluctuation analysis）Salvador

16、 Luria and Max Delbruck（1943）,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Newcombe的涂布實驗（1949）,影印實驗（replica plating ）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）,Joshua Lederberg,J. Lederberg

17、 is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,突變真的與選擇壓力無關嗎？,適應性突變（adaptive mutability）和高頻突變（hypermutation ）,Benson S.Adaptive mutation: a general phenomenon or special case?Bioessays. 1997 Jan;19(1):9

18、-11. Review.Galitski T, Roth JR. A search for a general phenomenon of adaptive mutability.Genetics. 1996 Jun;143(2):645-59.Dan I. Andersson, E. Susan Slechta, and John R. Roth Evidence That Gene Amplification Unde

19、rlies Adaptive Mutability of the Bacterial lac Operon。 Science 1998 November 6; 282: 1133-1135. Godoy VG, Fox MS. Transposon stability and a role for conjugational transfer in adaptive mutability.Proc Natl Acad

20、 Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7393-8.Bull HJ, McKenzie GJ, Hastings PJ, Rosenberg SM. Evidence that stationary-phase hypermutation in the Escherichia coli chromosome is promoted by recombination. Genetics. 2000 Apr

21、;154(4):1427-37.,基因突變及其機制,基因突變,,誘變,,堿基置換,移碼突變,點突變,,畸變,,缺失,添加,易位、倒位,自發(fā)突變,紫外線對DNA的損傷及其修復,UV導致遺傳物質產生嘧啶二聚體（TT、TC、CC），造成局部DNA分子無法配對，引起微生物的死亡或突變。一般微生物具有光復活作用。在利用UV進行誘變育種等工作時，應在紅光燈下進行照射和后繼操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。,突變與育種,一、自發(fā)突變與育種

22、 （breeding by spontaneous mutation） 1.從生產中育種。 仔細觀察，做“伯樂” 2.定向培育優(yōu)良菌株。 卡介苗（BCG vaccine）：Bacillus Calmette-Guerin,A.Calmette,C.Guerin,誘變育種（breeding by induced mutation）,誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促

23、進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數符合目的的突變株，以供科學試驗和生產實踐使用。,誘變育種的幾個原則,1.選擇簡便有效的誘變劑,誘變劑,,物理誘變劑：,化學誘變劑：,紫外線、激光、離子束、r－Ray,烷化劑、堿基類似物等,很多種化學物質，能以各種機制導致DNA的突變,,,a）利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進行誘變育種；,b）對有害微生物進行控制；,c）危害人類自身的健康,“生物化學統一性”法則：

24、,人和細菌在DNA的結構及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。,誘變劑的共性原則：化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比,超過95%的致癌物質對微生物有誘變作用90%以上的非致癌物質對微生物沒有誘變作用,回復突變(reverse mutation或back mutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復，這種第二次突

25、變稱為回復突變,美國加利福尼亞大學的Bruce Ames教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗,具體操作：檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復突變率,Ames試驗,證明Ames試驗重要性的應用實例：,國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應的藥物“反應?！保捎谄渌幮э@著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現畸形兒的出生率明顯增高，而且生產畸形兒的婦女大多

26、曾服用“反應?！保髞聿捎肁mes試驗發(fā)現這種物質的確具有很強的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免，,第四節(jié) 基因突變及修復,三、誘變劑與致癌物質——Ames試驗,由于生物體內、體外可能存在的差異，可在體外加入哺乳動物（如大鼠）微粒體酶系統，使待測物活化，使Ames試驗的準確率達80-90%。,誘變育種的幾個基本原則,2.挑選優(yōu)良的出

27、發(fā)菌株,依靠經驗,誘變育種的幾個基本原則,3.處理單細胞或單孢子懸液,誘變育種的細胞應盡量選用單核細胞，絲狀菌應選用單孢子。,誘變育種的幾個基本原則,4.選用最適的誘變劑量,劑量存活率曲線，劑量誘變率曲線。,誘變育種的幾個基本原則,5.充分利用復合處理的協同效應,誘變育種的幾個基本原則,6.利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產量間的相關指標,利用蛋白酶水解圈、淀粉酶變色圈、纖維素水解圈等,誘變育種的幾個基本原則,7.設計高效篩選方案,8.創(chuàng)造新型篩

28、選方法,結合具體的目標，大膽嘗試，勇于創(chuàng)新。,3類突變株的篩選方法,1.產量突變株的篩選,2.抗藥性突變株的篩選,梯度平板法定向培育若干代謝產物高產菌株,3.營養(yǎng)缺陷 型突變株的篩選,基本培養(yǎng)基：MM,M9 medium：Na2HPO4 12.8g KH2PO4 3.0g NaCl 0.5g NH4Cl 0.5g 葡萄糖(單獨滅菌) 10.0g 維生素B1(單獨滅菌) 1μg/mlpH 自然,不能錯誤的認

29、為基本培養(yǎng)基均是簡單的，不含生長因子的。,完全培養(yǎng)基：CM,Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30gNaCl 5g Agar (瓊脂) 15gDistilled water (蒸餾水) Adjust (調) pH to 7.0-7.2,可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。,補充培養(yǎng)基：CM,例如：在M9培養(yǎng)基中添加L－His等,只能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型突