Pseudomonas putida GM6聚磷相關(guān)基因的克隆和特性研究.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化是全球十大環(huán)境問(wèn)題之一。氮磷尤其是磷的輸入是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵因素。城鎮(zhèn)生活污水的排放是水體磷污染的主要來(lái)源之一。為解決磷污染所帶來(lái)的危害，在污水進(jìn)入水體前進(jìn)行有效處理，降低排放污水的磷濃度十分必要。目前世界各地大規(guī)模污水處理廠主要采用強(qiáng)化生物除磷工藝(Enhanced bidlogical phosphorus removal，EBPR)，EBPR工藝具有污泥產(chǎn)生量少、不使用化學(xué)物質(zhì)和運(yùn)行經(jīng)濟(jì)等特征。在EBPR系統(tǒng)中聚

2、磷菌在磷的去除中起著至關(guān)重要的作用。為此，加大對(duì)聚磷菌的聚磷特性、聚磷相關(guān)基因及聚磷菌的工程化應(yīng)用進(jìn)行研究十分必要。 本文以高效聚磷菌聚磷機(jī)理研究為主線，以高效聚磷菌GM6為研究材料，系統(tǒng)研究了高效聚磷菌的幾個(gè)與聚磷相關(guān)的ppk基因、ppx基因、phoU基因和phaZ基因等。通過(guò)對(duì)這些基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和敲除失活來(lái)研究菌株在強(qiáng)化廢水生物除磷工藝中的作用，取得了大量關(guān)于污水強(qiáng)化生物除磷菌基因調(diào)控過(guò)程的基礎(chǔ)研究成果。 一

3、．Pseudomonas putida GM6的ppk基因的克隆和敲除以及除磷特性研究 運(yùn)用SEFA-PCR的方法，從GM6中擴(kuò)增出多聚磷酸鹽激酶基因(ppk)，預(yù)測(cè)其全長(zhǎng)為2 220 bps，氨基酸水平比對(duì)發(fā)現(xiàn)與Pseudomonas putida KT2440的同源性為89％，Pseudomonas aeruginosa PAO1為80％，Acinetobacter sp. ADP158％，Escherichia coli

4、K12-MG1655為33％。通過(guò)構(gòu)建同源重組載體，經(jīng)兩次同源重組獲得了失去中間約1000bps的ppk突變株。 將突變株和原始菌株分別接入低磷培養(yǎng)基和合成廢水中進(jìn)行好氧培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)在同等初始OD值下，單位干重菌株所吸收的磷在重量上并無(wú)顯著差異；而當(dāng)初始OD值不相等時(shí)，OD值越大每毫克細(xì)胞干重所吸收的磷反而越少。用poly-P染色法對(duì)處于好氧培養(yǎng)狀態(tài)的突變株和原始菌株分別染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同等的條件下，用染色方法無(wú)法觀察到突變株菌

5、體內(nèi)有poly-P的存在，而卻能在原始菌株中觀察到。由于ppk基因參與催化合成長(zhǎng)鏈多聚磷酸鹽的，由第二個(gè)ppk基因(ppk2)來(lái)催化合成的短鏈多聚磷酸鹽在胞內(nèi)磷酸鹽積累過(guò)程中可能也發(fā)揮著重要的作用。 二．Pseudomonas putida GM6的ppx基因的克隆和敲除以及除磷特性研究 根據(jù)克隆ppk基因的方法從GM6中克隆到它的下游基因序列多聚磷酸酯酶基因(ppx)，該基因與ppk基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。ppx長(zhǎng)為1

6、500 bps，編碼500個(gè)氨基酸，以ATG作為起始密碼子，UGA作為終止密碼子。發(fā)現(xiàn)其氨基酸與Pseudomonas fluorescensPfO-1的同源性為88％，P. putida KT2440為84％，Pseudomonas syringae pv. syringaeB728a為83％。根據(jù)敲除ppk基因的方法設(shè)計(jì)兩同源臂，最后獲得失去中間約500 bps的ppx<'->突變株。將突變株和原始菌株分別接入低磷培養(yǎng)基和合成廢水中

7、進(jìn)行好氧培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始OD值相等時(shí)每毫克細(xì)胞干重所吸收的磷含量基本無(wú)差別，除磷效率并無(wú)明顯差異，生長(zhǎng)幅度也基本相同；但是，當(dāng)初始OD值不相等時(shí)，每毫克細(xì)胞干重所吸收的磷含量與初始OD值的大小成反比。通過(guò)poly-P染色后發(fā)現(xiàn)，原始菌株和突變株均能觀察到poly-P的存在，而用染色方法觀察到的poly-P應(yīng)該是長(zhǎng)鏈的。我們從厭氧釋磷實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩種菌做成切片后也能在細(xì)胞中觀察到較大的PHA顆粒，突變株中的顆粒少于原始菌株，且兩菌株在單

8、位時(shí)間內(nèi)的釋磷量和PHAs/MLSS值均成正比，但突變株的釋磷量明顯少于原始菌株，菌體合成的PHAs量占菌體干重的比例也低于原始菌株。這些結(jié)果表明，菌株GM6中可能還存在第二個(gè)ppx基因(ppx2)，它同樣能催化poly-P降解成正磷酸鹽，而且ppx2可能是一個(gè)水解短鏈poly-P的功能性基因。 三．GM6 phoU基因的克隆、KT2440 phoU基因的表達(dá)和敲除以及堿性磷酸酯酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性研究 根據(jù)ppk基因

9、敲除方法，獲得了KT2440的phoU突變菌株。將突變株和原始菌株分別點(diǎn)接于低磷和高磷MOPS(X-Pi)的平板上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株在高磷平板上由原來(lái)的白斑變成了藍(lán)斑。這表明菌株KT2440在失去phoU基因功能后，堿性磷酸酯酶能在高磷平板上表達(dá)了，這一結(jié)果證明了PhoU在磷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中是一個(gè)負(fù)調(diào)控蛋白。通過(guò)測(cè)定原始菌株和突變株的生長(zhǎng)值和堿性磷酸酯酶活力，發(fā)現(xiàn)突變株在LB培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)沒(méi)有原始菌株好；根據(jù)磷酸苯二鈉測(cè)定方法，突變株在這兩種培

10、養(yǎng)基上的酶活均高于原始菌株。 然后從KT2440中擴(kuò)增基因簇pstSCAB-phoU，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入GM6中得到表達(dá)菌株。但表達(dá)菌株仍于高磷的MOPS(X-Pi)平板上顯藍(lán)斑，表明KT2440中的phoU堪至phoU-pstSCAB基因簇并不能抑制GM6中堿性磷酸酯酶的表達(dá)。根據(jù)已報(bào)道的假單胞菌屬的phoU基因的保守序列從GM6中獲得了磷轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控系統(tǒng)的基因簇pstSCA-phoU片段序列，其中phoU基因與KT2440的此

11、蛋白同源性為92％。 四．Pseudomonas putida GM6的phaZ基因的克隆和敲除以及除磷特性研究 從GM6中擴(kuò)增出與PHA有關(guān)的基因簇(phaC1-phaZ-phaC2)，其中phaC1和phaC2均是PHA合成酶基因，phaZ基因是PHA解聚酶基因。預(yù)測(cè)phaZ基因全長(zhǎng)為852 bps，發(fā)現(xiàn)與P.putida的同源性為84％，Pseudomonas sp．PC17為87％，P.fluorescens

12、 PfO-1為88％。通過(guò)構(gòu)建同源重組載體和同源臂的交換獲得了GM6的phaZ<'->突變株D7。 將突變株和原始菌株分別接種于LB和低磷培養(yǎng)基(10μM)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株在這兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)值與原始菌株相比均減少了，且在低磷培養(yǎng)基中的減少幅度明顯大于LB培養(yǎng)基。厭氧釋磷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種菌做成切片在透射電子顯微鏡下觀察能明顯地看到細(xì)胞內(nèi)的PHA顆粒，且突變株的PHA顆粒略多于原始菌株。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的上清液磷濃度，結(jié)果又發(fā)現(xiàn)兩

13、菌株在一直保持初始OD值的條件下，原始菌株GM6在單位時(shí)間內(nèi)的釋磷量均比突變株D7明顯，且經(jīng)過(guò)相同時(shí)間兩菌株均到達(dá)最大釋磷量。通過(guò)對(duì)菌體干重和菌體內(nèi)的PHAs干重的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著菌體釋磷量的增大，兩種菌菌體內(nèi)的PHAs含量的比重逐漸增加，但單位時(shí)間內(nèi)菌體合成的PHAs量占菌體干重的比例卻不如D7高。 GM6和D7在合成廢水中的好氧生長(zhǎng)試驗(yàn)表明兩菌株的生長(zhǎng)情況與在LB培養(yǎng)基中的非常相似，經(jīng)過(guò)7 h均到達(dá)穩(wěn)定期，且突變株的長(zhǎng)勢(shì)略差于原始菌株