基因克隆載體ppt培訓(xùn)課件

1、3 基因克隆載體,定義通過不同途徑將承載的外源DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的DNA分子。也稱DNA克隆載體。必備條件1、克隆位點(diǎn)(一個(gè)或多個(gè))2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞: 能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。,按克

2、隆載體的來源分：質(zhì)?！《净蚴删w～質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～,按應(yīng)用范圍分： 表達(dá)型～ 啟動(dòng)子探針型～ cDNA ～,按應(yīng)用對(duì)象分： 原核生物～ 植物～ 動(dòng)物～,分 類,３.１ 質(zhì)?？寺≥d體定義： 以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫和c DN

3、A基因文庫。,一、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì)１、組成與構(gòu)型是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、綠藻）,構(gòu)型：,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,２、分子大?。?00～102 kb,３、復(fù)制特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)； 單向； 質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)控制,復(fù)制強(qiáng)度：拷貝數(shù)（細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定嚴(yán)緊控制型：1~數(shù)個(gè)拷貝；大質(zhì)粒松馳控制型：10個(gè)

4、以上拷貝；小質(zhì)粒。 經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個(gè)）。,（２）質(zhì)粒復(fù)制的控制因素 cop基因：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。,rep基因：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制,par序列：附著在細(xì)胞膜上，使質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而正確地分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù),４、質(zhì)粒的不親合性親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒不親和性

5、（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒５、質(zhì)粒遷移（１）接合質(zhì)粒： 含tra基因→合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等,（２）遷移作用不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物

6、時(shí)，即可打開oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱～,質(zhì)粒的遷移作用,６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥物的抗性基因，可作為選擇標(biāo)記。Col質(zhì)粒Ｆ質(zhì)粒降解質(zhì)粒Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒,二、 質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略

7、１、能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）２、克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿３、選擇標(biāo)記基因——抗性基因，Lac Z’基因４、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞15kb，轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動(dòng)子、終止子等,三、質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建過程：嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）構(gòu)建原則1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件

8、3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因4、選用合適的啟動(dòng)子5、構(gòu)建過程力求簡(jiǎn)單代表性實(shí)例。,（一）pBR322及其衍生質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建Ⅰ、pBR322構(gòu)建質(zhì)粒載體命名法則“pBR322” p：質(zhì)粒（plasmid )BR：兩位主要構(gòu)建者322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴(yán)緊型ColE1 松馳型 ，篩選系統(tǒng)復(fù)雜,構(gòu)建過程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1),R1（沙門氏菌中分離

9、） 變異 R1drd19 （含易位子Tn3 Apr） R1drd19 Tn3 pSF2124 ColE1 pBR322的三個(gè)親本：pMB1、pSF2124、pSC101識(shí)別位點(diǎn)：Apr基因區(qū)（3個(gè) ）： PstⅠ、Sca Ⅰ 、Pvu ⅠTcr基因區(qū)（7個(gè) ）：BamH Ⅰ 、Scal Ⅰ 、EcoRⅤ、Sph Ⅰ 、Nhe Ⅰ 、Nru Ⅰ 、XmaⅢTcr啟動(dòng)子區(qū)（2個(gè) ）

10、：Cla Ⅰ 、HindⅢpBR322分子大小：4363bp,,,3、優(yōu)點(diǎn)（1）較小的分子量10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）較高的拷貝數(shù)經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)1000～3000 copys/cell （3）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。插入失活（圖解）,Ⅱ、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個(gè)DNA片段（

11、lac Z`基因）替換Tcr基因；組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿命名p UC——University of California的科學(xué)家首先構(gòu)建。圖3-3。pUC包括四個(gè)組成部分：（1）pBR322的復(fù)制起點(diǎn)(ori)（2）Apr基因，但DNA序列發(fā)生變化，不再含原來限制性核酸內(nèi)切識(shí)別位點(diǎn) （3）lacZ`基因 （4）在lacZ`基因 內(nèi)部靠近5`端有一段MCS連桿,4、pBR322衍生的質(zhì)粒 缺

12、失bom位點(diǎn)→ pBR325、 pBR327，不具被動(dòng)遷移作用 再移去HaeⅡ片段→pAT153 均更安全,Lac Z`篩選機(jī)制：含乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽) 合成有活性的 基因（lac Z`）的質(zhì)粒載體引入可編 β-半乳糖苷酶 碼C端部分殘基的宿主(與Lac Z`互補(bǔ) 的大腸桿菌) 在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和 X-g

13、al（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖） 藍(lán)色菌落的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS 不影響lac Z`基因功能 插入外源DNA 滅活lac Z`基因 白色菌落,,,,,,,,,pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)（1）分子量更小、拷貝數(shù)更高（2）免疫組化法一步實(shí)現(xiàn)篩選鑒定重組體，省時(shí)（3）MCS區(qū)方便轉(zhuǎn)移外源DNA在不同載體系列中 “穿梭”，使具有

14、兩種不同粘末端的外源DNA 能直接克隆入p UC載體,（二）藍(lán)藻質(zhì)?？寺≥d體pPKE2的構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)化藍(lán)藻藍(lán)藻內(nèi)的質(zhì)粒屬隱蔽質(zhì)粒即：大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn) + 藍(lán)藻源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)。 pPbs（1511bp）pPbs ClaⅠ 重組 pPRS-1 多次亞克隆 pPKE-2pBR322 組裝CaMV35s啟動(dòng)子、MCS、rb

15、cS終止子、Kmr基因（圖3-5）,,,,↑,,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒,,,（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建 Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤）的質(zhì)粒，故稱Tumor inducing plasmid（Ti質(zhì)粒）。雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250kb?！?、4個(gè)功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū)?。?）T-DNA區(qū)　　Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的約25kb部分，即T-DNA （transfer

16、DNA)。左右邊界各有一個(gè)25bp正向重復(fù)序列（LTS和RTS）稱為邊界序列，為T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列，中間序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中?！　　∵@是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)?！　　∮靡吧蚑i質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉(zhuǎn)基因植物。,（2）Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，顯示致瘤性。（3）Co

17、n區(qū)含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra)，可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。Ti質(zhì)?？寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。,2、構(gòu)建途徑（1）取代型載體。用大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體取代Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA序列而構(gòu)建。外源基因以同源交換而重組。 Onc-　Ti：T-DNA上的onc基因被取代而構(gòu)

18、建。 Onc+　Ti：pBR322取代 T-DNA的部分序列但保留onc基因而構(gòu)建。進(jìn)入植物細(xì)胞誘發(fā)冠癭瘤。,,（2）中間質(zhì)粒克隆載體T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構(gòu)建。共整合克隆載體系統(tǒng)（T-DNA同源序列、bom 位點(diǎn)）雙元克隆載體系統(tǒng)——微型Ti質(zhì)粒,（四）乳酸桿菌質(zhì)?？寺≥d體乳酸桿菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和飲料。質(zhì)粒宿主范圍廣泛：可用于其它G+菌及大腸桿菌。構(gòu)建：乳酸

19、桿菌本身對(duì)km、Ap抗性較強(qiáng)。 標(biāo)記基因： 選用lacZ，如有pLJ1復(fù)制啟始位點(diǎn)的pBG10 選用ery，如有p353-2復(fù)制啟始位點(diǎn)的pP3537,（五）酵母2μm質(zhì)?？寺≥d體幾乎所有釀灑酵母中都存在,,,（1）2μm質(zhì)粒結(jié)構(gòu)a、環(huán)狀分子內(nèi)有反向重復(fù)序列IR1和IR2，可發(fā)生重組，形成A、B型質(zhì)粒；有ori復(fù)制起始點(diǎn)能自主復(fù)制。,圖3-10　A型酵母2μm質(zhì)粒,b、20～80個(gè)/細(xì)胞。有絲分裂時(shí)數(shù)目穩(wěn)定，減數(shù)分裂

20、時(shí)形成cir+/cir0,（2）YEp克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒） 　2μm質(zhì)粒的ori　→　EcoRⅠ酶切 pBR322質(zhì)粒 酵母染色體URA3基因→HindⅢ酶切 　　YEp24

21、 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　?。▓D3-11）,,,,,,特征　（1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——篩選大腸桿菌克隆子（2）含URA3標(biāo)記——篩選酵母菌克隆子 （3）URA3基因——補(bǔ)償酵母菌ura3突變優(yōu)點(diǎn)（1）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)制（2）轉(zhuǎn)化率高，1μgDNA可獲得約104～105個(gè)克隆子（3）穩(wěn)

22、定高拷貝復(fù)制 故可用酵母菌高水平表達(dá)外源目的基因,（六）TA克隆載體——針對(duì)PCR產(chǎn)物的克隆原理PCR產(chǎn)物在Taq酶的非模板依賴活性作用下，于3`端加一非配對(duì)的A。故可研制一種線性載體，其5`端各帶一不配對(duì)T，可直接與PCR產(chǎn)物以TA連接進(jìn)行克隆，即TA克隆。TA載體的再生方法（1）克隆載體線性化（2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng)（3）克隆載體末端加T反應(yīng)注：再生后的TA載體，原線性化的酶切位點(diǎn)消失,思考題1、

23、名詞解釋：基因克隆載體、遷移作用、接合質(zhì)粒、MCS、穿梭質(zhì)粒、TA克隆2、任一DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？3、構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設(shè)計(jì)原則？4、指出pBR322的結(jié)構(gòu)來源，并圖示pBR322的構(gòu)建。5、簡(jiǎn)述Lac Z`的篩選機(jī)制。6、p UC質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu)組成。7、酵母2μm質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)有何特征？,3．2　　病毒（噬菌體）克隆載體,病毒基本結(jié)構(gòu)： DNA（或RNA）+ 外殼蛋白

24、感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。分類（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系）：溫和性病毒：溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體烈性病毒：溶菌性增殖→改造后,,,,一、λ噬菌體克隆載體,,（一） λ噬菌體性質(zhì)λDNA + 外殼蛋白1、λDNA (48.5kb) 噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn)),2、λ噬菌體基因組有基因50個(gè)以上,J與N、P與Q之間為非必需序列,3、 限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn): 56種（p477） 4、 λ噬菌體的生

25、長(zhǎng)途徑溶菌生長(zhǎng)途徑溶原生長(zhǎng)途徑→某種脅迫條件下→合成six 基因產(chǎn)物→λ DNA脫離細(xì)菌染色體→溶菌,,（二）構(gòu)建依據(jù)1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體2、能承載較大的外源DNA片段λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kb λDNA可缺失（生長(zhǎng)非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線策略: 切去部分非必需區(qū)，刪掉多余的限制性內(nèi)切酶

26、位點(diǎn)，插入選擇性標(biāo)記基因，建立體外包裝系統(tǒng)。,技術(shù)路線1、用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以g t WES – λ β為例，EcoRI（如圖）。（48.5kb） λDNA E co R I 6個(gè)片段其中： B片段是λ噬菌體生長(zhǎng)非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長(zhǎng)途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉min5序列（2.6kb）。兩端E coR I別點(diǎn)經(jīng)點(diǎn)突變或甲基化處理，即得g

27、t WES–λ β：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb）,,克隆能力：替換B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最?。?6.4-(40.4-4.9)=0.9kb實(shí)際應(yīng)用時(shí)克隆能力略有出入（p109,表3-5）2、在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因 （1）取代red和gam基因外源DNA取代 獲Spi-表型 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中能生長(zhǎng) 野生型λ噬菌體

28、(Spi+表型) 在P2噬菌體溶原性細(xì)胞中不能生長(zhǎng)局限性：只能以P2噬菌體溶原細(xì)胞作為受體 （2）最常用的篩選標(biāo)記：Lac Z基因,,,,3、建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)體外重組DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。野生型λ噬菌體感染的細(xì)胞中無多余的外殼蛋白。D-（D基因缺失噬菌體）→受體細(xì)胞→積累除D蛋白以外所有蛋白質(zhì)E-（E基因缺失噬菌體）→受體細(xì)胞→積累除E蛋

29、白以外所有蛋白質(zhì)混合 D、E互補(bǔ) 包裝λDNA分子 → λ噬菌體 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-),,,,,（四） λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用建立c DNA基因文庫 克隆外源目的基因（五）重組λDNA分子的體外包裝（自學(xué)）,二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）（一）構(gòu)建策略由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid,（二） cosmid

30、的特征1、環(huán)形雙鏈DNA分子,　≤36.4kb,　一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制3、含有一個(gè)cos位點(diǎn) A蛋白 cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長(zhǎng)途徑、溶原生長(zhǎng)途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。因此，co

31、smid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。,,（三）使用cosmid載體的基本程序利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞利用cosmid的λ噬菌體性質(zhì)→轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞（下圖）,三、M13噬菌體克隆載體（一）M13 DNA絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA）大?。?.4kb結(jié)構(gòu)：10個(gè)區(qū)　　　　基因間隔區(qū)（IS區(qū)）,含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn),（二）M13DNA復(fù)制和M13噬菌體

32、增殖　 M13 DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌→合成“-”鏈→產(chǎn)生雙鏈M13 DNA（復(fù)制型DNA或RF-DNA）→按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時(shí)以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白 →RF-DNA達(dá)200拷貝時(shí)，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈 →結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈 →“+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體 →擠出受體細(xì)

33、胞 →宿主細(xì)胞不被溶菌。,M13 DNA復(fù)制特征：以雙鏈DNA為中間媒介培養(yǎng)物→高速離心→上清中含噬菌體顆?！?”鏈DNA沉淀菌體→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑策略： 在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適ＭＣＳ。 RF-DNA上有10個(gè)B su I位點(diǎn)→部分酶切→獲得全長(zhǎng)線形RF-DNA, 與含LacZ`標(biāo)記的HindⅢ酶切片段進(jìn)行平末端連接

34、→M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點(diǎn),可在Lac Z`區(qū)插入ＭＣＳ連桿　 構(gòu)建成對(duì)M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。,（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作2、制備的M13 DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌，直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13 DNA分子6倍的DNA分子4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈

35、DNA分子主要用途：克隆、分離單鏈外源DNA片段　　獲得的“+”鏈可直接用于DNA測(cè)序,四、Ca MV克隆載體花椰菜花葉病病毒（CaMV）　環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV　DNA分子大?。?kb結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負(fù)鏈有一缺口， 正鏈有兩缺口。進(jìn)入植物細(xì)胞后單鏈部分被 酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。,（二）Ca MV基因區(qū)8個(gè)閱讀框（ORF）和3個(gè)間

36、隔區(qū)（IR1～3）IR1－ ORF VI與ORF VII之間IR2－ ORF VII與ORF I之間IR3－ ORF V與ORF VI之間IR1 和IR3區(qū)各有一個(gè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分別啟動(dòng)同方向轉(zhuǎn)錄35S RNA和19S RNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。 35S啟動(dòng)子——組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。組裝了35S啟動(dòng)子的外源基因可在植物細(xì)胞高效表達(dá)，在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)也有效表達(dá)。,（三） Ca MV的增殖和感染　 1、增殖

37、途徑：Ca MV顆?！料x→病毒DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核→轉(zhuǎn)錄19S RNA→翻譯 35S RNA 　翻譯　　　　 反轉(zhuǎn)錄　　　　　　“-”鏈DNA →復(fù)制出“+”鏈2、Ca MV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞在ORF II和ORF VII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植 物細(xì)胞,,,,,,,包裝成新的Ca MV顆粒,（四）構(gòu)建Ca MV克隆載體的基本策略和途徑 策略Ca MV-DNA

38、能侵入植物細(xì)胞而將目的基因?qū)?，并且清除Ca MV對(duì)植物的致病性基因途徑1、構(gòu)建互補(bǔ)克隆載體: 組裝(目的基因+標(biāo)記基因)而無感染能力+兩種基因和感染能力都無→彼此獲得對(duì)方產(chǎn)物→感染能力2、構(gòu)建置換型克隆載體 置換的外源基因較小3、構(gòu)建混合型克隆載體 Ca MV-DNA →合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構(gòu)建4、構(gòu)建Ca MV-融合基因克隆載體系統(tǒng)將35S啟動(dòng)子與目的基因融合，高效表達(dá)目的基因。,五

39、、煙草花葉病毒（TMV）克隆載體單鏈正義RNA，6395bp特點(diǎn)：復(fù)制量和外殼蛋白表達(dá)量高，寄主范圍廣，能在整株植物上快速擴(kuò)散TMV載體構(gòu)建策略有四種基本形式（圖3-20）,六、SV40克隆載體——哺乳動(dòng)物基因克隆載體（猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因組雙鏈閉環(huán)DNA：5243bp,酶切位點(diǎn)：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：Bam HⅠ、BstⅠ、TapⅠ識(shí)別序列晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)：AccⅠ、NaeⅠ、HaeⅡ、HpaⅡ 、EcoRⅠ、

40、BanⅠ、EcoRⅤ 、AflⅡ轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)：BglⅠ、SfiⅠ都只有一個(gè)識(shí)別序列,（二）SV40-DNA復(fù)制與增殖猿猴細(xì)胞——受納細(xì)胞嚙齒動(dòng)物（小鼠、倉(cāng)鼠）——非受納細(xì)胞；細(xì)胞癌變?nèi)耍?～2%細(xì)胞產(chǎn)生病毒顆粒，不會(huì)插入染色體，相對(duì)安全（三）構(gòu)建策略和途徑包裝嚴(yán)格，不能包裝大于SV40-DNA的分子，只能構(gòu)建取代型載體或SV40-DNA與質(zhì)粒DNA的重組型載體1、取代型被取代的DNA序列不能超過SV40-DN

41、A的30%（1）晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：需輔助載體共同轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞（2）早期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：輔助細(xì)胞系（將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列整合到敏感細(xì)胞基因組上）,2、病毒-質(zhì)粒重組克隆載體：質(zhì)粒載體的衍生物（1）病毒 -質(zhì)粒重組克隆載體（穿梭質(zhì)粒） ：含SV40完整早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和DNA復(fù)制起始點(diǎn)，及質(zhì)粒DNA的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇性標(biāo)記（2）微型病毒復(fù)制子質(zhì)粒載體：只含SV40復(fù)制起始點(diǎn)七、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體：一類RNA病毒（

42、一）勞斯肉瘤病毒的生物學(xué)特性,RSV：含兩條相同的38S RNA（右圖）; 與宿主細(xì)胞提供的tRNATrp結(jié)合處： PBS +ve、PBS -ve,RSV的復(fù)制與增殖：（右圖）接上長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）,策略：RNA病毒不能直接構(gòu)建，必須從感染動(dòng)物細(xì)胞中分離出原病毒DNA，按不同需求刪去部分序列，組入選擇標(biāo)記、目的基因、調(diào)控元件，再克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，才可獲重組載體。,（二）構(gòu)建RSV載體的策略和途徑,1、反轉(zhuǎn)錄病毒-質(zhì)粒載體

43、關(guān)鍵步驟：體外刪去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5’和3’LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包裝）位點(diǎn)，插入合適的選擇標(biāo)記如neo、gpt等。(如圖),需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒 ↓Gag、Env蛋白　　 ↓識(shí)別包裝位點(diǎn)psi ↓將重組的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝成新的病毒顆粒,新病毒能合成各種所需的蛋白質(zhì)。,特點(diǎn)：更高的轉(zhuǎn)化效率，基因轉(zhuǎn)移成功率100%改進(jìn)：鑒于危險(xiǎn)性，已建立了不需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒

44、的克隆載體系統(tǒng)。將缺失psi位點(diǎn)的原病毒DNA轉(zhuǎn)化動(dòng)物受體細(xì)胞，獲得全部包裝蛋白質(zhì)，即輔助細(xì)胞。2、廣宿主反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體組入能感染多種動(dòng)物細(xì)胞的env基因3、反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)克隆載體可插入6kb的外源基因。若剪短原病毒DNA，則可承載20kb,八、腺病毒克隆載體（一）腺病毒的一般生物學(xué)特性Ad：無囊膜的20面體，含一個(gè)線形雙鏈DNA分子，約36kb。Ad-DNA兩端具有逆向末端重復(fù)序列（IRT），5`端共價(jià)結(jié)合一

45、種5.5kD的蛋白質(zhì)（TP），進(jìn)入宿主細(xì)胞后Ad-DNA自行環(huán)化。,（二）腺病毒載體構(gòu)建特點(diǎn)：易感染性、宿主范圍廣、毒性低（安全）、可容納的外 源基因大、不整合入宿主染色體DNA。 基因轉(zhuǎn)移中最有前途的克隆載體之一人類腺病毒有51個(gè)血清型，常用的是Ad5和Ad2型。進(jìn)入宿主細(xì)胞后以復(fù)制為界分早晚兩個(gè)基因表達(dá)時(shí)期。早期基因(E 1～E４)編碼調(diào)節(jié)因子，晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。野生型腺病毒容納最大外源DNA為2kb。理論上

46、，除基因組兩端約500bp的順式結(jié)構(gòu) 和 包裝必需結(jié)構(gòu) 外，其他結(jié)構(gòu)均可被替換成外源DNA。策略：構(gòu)建一個(gè)含MCS和篩選標(biāo)志的質(zhì)粒（有病毒基因組某端早期序列）　　將一表達(dá)盒（啟動(dòng)子—外源基因—Poly A ）插入E1、E3區(qū)或E4至右IRT之間 穿梭質(zhì)粒； 再構(gòu)建含非必須區(qū)基因缺失的環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒，在菌體復(fù)制； 穿梭質(zhì)粒 + 環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒 同源重組 重組載體。,,,,,例：重組Ad-hFVⅢ構(gòu)建（如圖

47、）,改進(jìn)：構(gòu)建能在野生型Ad感染的各種靶細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制的Ad載體。（三）Ad克隆載體的應(yīng)用1、基因治療癌癥（1）導(dǎo)入腫瘤抑制基因和反義癌基因（2）導(dǎo)入前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因——病毒引導(dǎo)的前體藥物治療（3）導(dǎo)入核酶基因，降低癌基因的表達(dá)水平2、表達(dá)真核基因3、研究疫苗,九、痘苗病毒克隆載體（一）生物學(xué)性質(zhì)線形雙鏈DNA分子，180～200kb，編碼200多種蛋白（二）構(gòu)建方法：痘苗病毒的基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尚無質(zhì)粒型的

48、痘苗病毒克隆載體，因此必須采用同源重組方法構(gòu)建,痘苗病毒克隆載體特點(diǎn)：1）表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的活性和理化性質(zhì)相近2）外源目的基因和載體的免疫原性均較好3）外源基因的插入量大4）宿主細(xì)胞廣泛5）表達(dá)產(chǎn)物可翻譯后修飾，無需佐劑，純化簡(jiǎn)單，產(chǎn)物穩(wěn)定，易于保存運(yùn)輸十、桿狀病毒克隆載體自學(xué)要點(diǎn)：基因組特性，同源重組方式，陽性克隆檢測(cè)，表達(dá)特點(diǎn)。,思考題1、名詞解釋：Cos位點(diǎn)、受納細(xì)胞、非受納細(xì)胞2、構(gòu)建λ

49、噬菌體載體的策略及其技術(shù)路線。3、試從cosmid克隆載體的構(gòu)建策略上說明其特征。4、簡(jiǎn)述病毒的溶原性和溶菌性增殖途徑。5、M13噬菌體載體有何優(yōu)點(diǎn)和用途？6、簡(jiǎn)述腺病毒克隆載體的策略及其主要用途。7、痘苗病毒克隆載體有何特點(diǎn)？為什么要用同源重組方式構(gòu)建？8、如何構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體？舉例說明。,3．3染色體定位整合克隆載體質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足：1、轉(zhuǎn)基因生物中游離的外源DNA分子能多拷貝復(fù)制，但易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生

50、物的不穩(wěn)定性2、隨機(jī)插入染色體的外源DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點(diǎn)不確定，可能干擾受體細(xì)胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度基因整合平臺(tái)系統(tǒng)——基因定位同源重組(基因打靶)整合平臺(tái)：即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域，是外源DNA 　　　定位整合的位置定位整合克隆載體：除一般質(zhì)粒克隆載體必備的元件外，還　　　含有一個(gè)或兩個(gè)與整合平臺(tái)DNA區(qū)域核酸序列同源的

51、 DNA片段（長(zhǎng)度最好＞1kb）,一、定位整合克隆載體的幾種模式（一）內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體,（二）外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體,（三）內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體,（四）內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體,二、定位整合效率與受體細(xì)胞的種屬和同源DNA片段的長(zhǎng)短有關(guān)整合效率偏低，有待改進(jìn),三、定位整合克隆載體受體生物：原核生物藍(lán)細(xì)菌、高等植物（擬南芥、水稻等）的原生質(zhì)體、動(dòng)物鼠的胚胎干細(xì)胞、人的細(xì)胞整合平臺(tái)：內(nèi)源　isiAB、cp

52、cB2A2、hprt、rDNA　　外源　hptΔ、aphⅡ,（一）藍(lán)藻染色體定位整合克隆載體1、絲狀藍(lán)藻Calothrix sp.PCC7601　獲得含藻藍(lán)蛋白基因cpcB2A2的DNA片段，以之為同源序列，構(gòu)建～,2、從其cpc2操縱子中擴(kuò)贈(zèng)出cpc2啟動(dòng)區(qū)（約0.6kb）、同源DNA片段L（約1.2kb）和R（約1.15kb）構(gòu)建如下載體：,3、Synechococcus 從sp.PCC7942獲得含isiAB基因的約1

53、.5kb的DNA片段，構(gòu)建p ZL： 不含藍(lán)藻源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，故不能在藍(lán)藻細(xì)胞質(zhì)中自行復(fù)制,（二）酵母菌染色體定位整合克隆載體,（三）植物染色體定位整合克隆載體易于控制；避免插入失活或突變。,（四）動(dòng)物染色體定位整合克隆載體,３．４　　人工染色體克隆載體一、人工染色體克隆載體含義和特點(diǎn)實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），還含有第二受體（如酵

54、母菌）染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。特點(diǎn)：能容納長(zhǎng)達(dá)1000至3000kb的外源DNA片段。二、人工染色體克隆載體的構(gòu)建YAC（酵母人工染色體）常用載體：pYAC3、 pYAC4、pYAC5,三、人工染色體克隆載體的應(yīng)用構(gòu)建基因組文庫基因治療基因功能鑒定,３．５　　　特殊用途克隆載體一、啟動(dòng)子探針型克隆載體應(yīng)用范圍：研究生物的發(fā)育機(jī)制提高目的基因表達(dá)產(chǎn)量進(jìn)行基因治療組

55、成結(jié)構(gòu)：必備轉(zhuǎn)化系統(tǒng)　+　檢測(cè)部件檢測(cè)部件：一個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因及克隆位點(diǎn)。,1、Kanr標(biāo)記：用于植物細(xì)胞Kanr基因→ Kanr蛋白卡那霉素 磷酸化卡那霉素→不能進(jìn)入細(xì)胞,,,ATP,2、gfp標(biāo)記: 用于真核及原核細(xì)胞gfp基因→ GFP（綠色熒光蛋白) 395nm/470nm 發(fā)射510nm（綠色熒光）,,3、hph標(biāo)記:　用于真核及原核細(xì)胞潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（

56、hph）,二、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體指啟動(dòng)子必須在特殊的誘導(dǎo)條件下才有轉(zhuǎn)錄活性或比較高的轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)克隆載體誘導(dǎo)條件：二價(jià)金屬離子、紅光、熱、干旱1、金屬硫蛋白（MT）啟動(dòng)子,2、干旱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)積累果聚糖和海藻糖能不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性。干旱誘導(dǎo)性啟動(dòng)子：Prd29A,3、紅光誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體藻藍(lán)蛋白操縱子2（cpc2)→藍(lán)藻表達(dá)克隆載體pUTK2（圖3-34）4、熱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體

57、groESL啟動(dòng)子→藍(lán)藻基因整合平臺(tái)表達(dá)克隆載體pZL（圖3-35）,三、反義表達(dá)克隆載體-人工干預(yù)基因表達(dá)利用人工合成或重組的、與靶基因互補(bǔ)的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結(jié)合，從而達(dá)到封閉其表達(dá)的目的。應(yīng)用：基因治療和基因功能的研究1、SOD基因反義表達(dá)克隆載體,2、NHE1基因反義表達(dá)克隆載體人肺癌細(xì)胞Na+/H+交換泵1（ NHE1）,四、組織特異性表達(dá)克隆載體1、乳腺組織特異性表達(dá)克隆載體基因工

58、程藥物的生物反應(yīng)器人凝血因子Ⅸ,另外，EPO、hALB均在動(dòng)物乳腺組織中得以表達(dá)。,2、腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)克隆載體基因治療常用攜帶某種目的基因（c DNA）的特定載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，希望能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)產(chǎn)物，殺傷腫瘤細(xì)胞?！?dú)[瘤細(xì)胞的同時(shí)，正常細(xì)胞也受到損傷。腫瘤細(xì)胞中特異性高效表達(dá)的啟動(dòng)子與腫瘤殺傷基因組成嵌合基因。,3、神經(jīng)組織特異性表達(dá)克隆載體早老性癡呆（AD）淀粉樣前體蛋白（βAPP）　　 衍生